Establishing the fast-growing bacterium Vibrio natriegens as a next-generation chassis for synthetic biology
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Vibrio natriegens is the fastest-growing organism known to date with a minimal doubling time of less than ten minutes under optimal conditions. Due to this exciting property and also because of its capability to use a wide range of carbon sources, it was proposed as a novel chassis for Synthetic Biology and Biotechnology. However, so far reports about successful applications of V. natriegens are scarce. This is likely due to the lack of efficient and reliable genetic tools. Furthermore, the knowledge about the biology of V. natriegens is still limited, which leads to unforeseeable challenges for its application. In combination, these two reasons have prevented the widespread application of V. natriegens in Synthetic Biology so far.
In this cumulative thesis I describe my contribution to tackling these limitations.
Within the scope of this thesis, two CRISPR-Cas9-based tools were added to the set of available methods for V. natriegens.
The first tool is NT-CRISPR. This method was developed to improve our ability to perform genomic modifications in V. natriegens. NT-CRISPR relies on V. natriegens’ ability to take up free DNA from the environment in a process called natural transformation. This can be used to introduce a wide range of genomic modifications, such as deletions, integration of foreign DNA or the introduction of point mutations. In a subsequent step, CRISPR-Cas9 is activated to selectively kill non-modified cells, thereby drastically increasing the efficiency of genome modification by natural transformation. It was demonstrated that genome engineering can be performed with high efficiencies for various types of modifications, as well as for the simultaneous deletion of three sequences.
In addition to NT-CRISPR, which leads to permanent genetic modifications, graded-CRISPRi was developed as a tool for the inducible repression of genes in V. natriegens. By using two different inducible promoters, a tightly regulated system was created, which does not show any activity in the absence of the inducers. Furthermore, libraries with gRNAs of different lengths and mismatches to the target sequence were used to generate graded knockdown strengths. This concept was applied to four different reporter genes to demonstrate that graded-CRISPRi can be used to generate various expression levels of multiple targets in V. natriegens. Lastly, graded-CRISPRi was targeted against native genes to study the relationship between protein abundance and growth behavior.
In addition to developing genetic tools, some progress has been made regarding the understanding of the rapid growth of V. natriegens. Like almost all strains of the Vibrionaceae family, V. natriegens has a bipartite genome configuration. The two chromosomes were fused to generate the monopartite strain synSC1.0. A phenotypic characterization in comparison to the parental strain revealed that synSC1.0 did not show any major difference. This led to the conclusion that the bipartite genome configuration of V. natriegens is not a requirement for its rapid growth.
Vibrio natriegens ist der bislang am schnellsten wachsende bekannte Organismus mit einer Verdopplungszeit von unter zehn Minuten unter optimalen Bedingungen. Wegen dieser interessanten Eigenschaft und wegen der Fähigkeit eine große Spanne von Kohlenstoffquellen zu nutzen, wurde V. natriegens als neuer Chassis Organismus für die Synthetische Biologie und Biotechnologie gehandelt. Jedoch sind Berichte über erfolgreiche Anwendungen von V. natriegens in diesen Bereichen bislang selten. Dies liegt vermutlich an dem Fehlen von effizienten und zuverlässigen genetischen Werkzeugen. Außerdem ist bislang das Wissen über die Biologie von V. natriegens sehr begrenzt, was zu unvorhersehbaren Herausforderungen bei der Nutzung führen kann. In Kombination haben diese beiden Gründe bislang die breite Anwendung von V. natriegens in der Synthetischen Biologie verhindert.
In dieser kumulativen Dissertation beschreibe ich meinen Beitrag dazu, diese Einschränkungen zu beheben.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei CRISPR-Cas9-basierte Werkzeuge zu dem Set an verfügbaren Methoden für V. natriegens hinzugefügt.
Das erste Werkzeug ist NT-CRISPR. Diese Methode wurde entwickelt, um unsere Fähigkeit zu verbessern das Genom von V. natriegens modifizieren zu können. NT-CRISPR basiert auf der Fähigkeit von V. natriegens freie DNA aus der Umwelt aufzunehmen. Dieser Prozess wird natürliche Transformation genannt. Natürliche Transformation kann benutzt werden, um eine breite Spanne an genetischen Modifikationen einzubringen, wie Deletionen, Integration von fremder DNA oder der Erzeugung von Punktmutationen. In einem nachgeschalteten Schritt wird CRISPR-Cas9 aktiviert. Dadurch werden selektiv nicht modifizierte Zellen getötet, um die Effizienz der Methode zu erhöhen. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene Arten von genomischen Modifikationen mit hoher Effizienz durchgeführt werden können. Weiterhin war die gleichzeitige Deletion von drei Sequenzen möglich.
Zusätzlich zu NT-CRISPR, welches zu einer permanenten genetischen Veränderung führt, wurde graded-CRISPRi entwickelt für eine induzierbare Repression von Genen in V. natriegens. Durch die Nutzung von zwei verschiedenen induzierbaren Promotoren konnte ein streng reguliertes System entwickelt werden. Dieses zeigte keine Aktivität in Abwesenheit der Induktoren. Außerdem wurden gRNA-Varianten mit verschiedenen Längen und mit Fehlern zur Zielsequenz verwendet, um abgestufte Knockdowns zu ermöglichen. Dieses Konzept wurde außerdem auf vier verschiedene Reportergene angewendet, um eine Vielzahl an Expressionsleveln bei mehreren Zielgenen zu erzeugen. Abschließend wurde graded-CRISPRi gegen native Gene gerichtet, um den Zusammenhang zwischen der Proteinmenge und dem Wachstumsverhalten zu untersuchen.
Zusätzlich zur Entwicklung von genetischen Werkzeugen wurden Fortschritte im Verständnis des schnellen Wachstums von V. natriegens erzielt. Wie fast alle Stämme der Vibrionaceae Familie, hat auch V. natriegens eine zweigeteilte Genomkonfiguration. Die beiden Chromosomen wurden fusioniert um den Stamm synSC1.0 zu erzeugen, der ein einzelnes Chromosom besitzt. Eine phänotypische Charakterisierung im Vergleich zum Ausgangsstamm zeigte keine auffälligen Unterschiede gibt. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass die zweigeteilte Genomkonfiguration von V. natriegens keine Voraussetzung für das schnelle Wachstum ist.