Diagnostik der messbaren Resterkrankung bei Akuten Myeloischen Leukämien durch Next Generation Sequencing von zirkulierender zellfreier DNA
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Die Analyse der MRD hat bei der AML in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Unter einem MRD-Nachweis wird der Nachweis residueller leukämischer Zellen unter der mikroskopischen Nachweisgrenze von 5 % verstanden. Der Nachweis einer solchen MRD hat sich in mehreren Studien als prognostisch bedeutsam herausgestellt, sodass die MRD-Quantifizierung vermehrt in die Therapieplanung bei Patienten mit einer AML einbezogen wird. Der Nachweis erfolgt in der Regel mittels hochsensitiver molekularbiologischer Verfahren wie beispielsweise qPCR oder NGS. Der Vorteil des NGS besteht primär darin, dass das NGS ohne mutationsspezifische Reagenzien auskommt und somit eine simultane sowie schnelle Analyse multipler Gene ermöglicht. Die Grundlage für eine NGS-basierte MRD-Analyse bildet der Nachweis mindestens einer AML-assoziierten Mutation, die hinsichtlich des Verlaufs ihrer Mutationslast nachverfolgt werden kann. Neben der genomischen DNA aus leukämischen Zellen kommt dabei auch die im Blutplasma zirkulierende cfDNA infrage (Liquid Biopsy). Der Vorteil der cfDNA als Probenmaterial, insbesondere aus Patientensicht, besteht darin, dass die cfDNA über eine gering invasive periphere Blutentnahme entnommen werden kann, während die Knochenmarkpunktion einen meist schmerzhaften und risikoreicheren Eingriff darstellt. Da die cfDNA den leukämischen Zellen im Knochenmark (oder aus extramedullären Manifestationen) direkt entstammt, stellt sie dabei das gesamte molekulargenetische Profil der AML-Erkrankung dar. Im Rahmen dieser Studie sollte überprüft werden, ob sich die cfDNA als minimal-invasiv gewonnenes Probenmaterial für ein MRD-Monitoring mittels NGS eignet und den Nachweis AML-assoziierter Mutationen ermöglicht.
Dazu wurden insgesamt 75 cfDNA-Proben von 29 an AML erkrankten Patienten, die am UKGM Marburg behandelt wurden, entnommen und analysiert. Die Analyse erfolgte mittels eines Targeted-Sequencing-Ansatzes auf Basis von zwei kommerziell erhältlichen Multi-Gen-Panels, die 10 bzw. 37 Hotspot-Regionen in AML-assoziierten Genen abdeckten (VariantPlex-Core-AML oder Core-Myeloid, Archer Dx). Das Mutationsspektrum in den cfDNA-Proben wurde mit den Ergebnissen der molekularbiologischen Untersuchungen, die im Rahmen der Routinediagnostik in einem externen Referenzlabor durchgeführt wurden, verglichen.
Es konnte aus allen Proben ausreichend cfDNA für eine molekularbiologische Analyse isoliert werden, wobei sich keine signifikanten Unterschiede zwischen CR- und non-CR-Proben ergaben. Bei insgesamt 48 von 75 (64 %) der Proben konnte die vom Hersteller empfohlene Read-Anzahl (Core AML: 750 000; Core Myeloid: 3 Mio.) erreicht werden. Die Sensitivität stieg dabei mit zunehmender Read-Anzahl sowie mutationsspezifischer Sequenziertiefe. So konnte in 70,3 % der CR-Proben mit ausreichender Read-Anzahl, jedoch nur in 33,3 % der CR-Proben mit niedriger Read-Anzahl eine MRD-Positivität detektiert werden. Bei non-CR-Proben, bei denen die Mutationslast erwartungsgemäß höher ist, konnte auch bei niedriger Read-Anzahl in allen Proben eine MRD-Positivität nachgewiesen werden. Die Analyse der cfDNA ermöglichte den Nachweis mindestens einer bekannten Mutation in 32 von 55 (58,2 %; VAF: 0,08–78,04 %) aller cfDNA-Proben, die zu Zeitpunkten entnommen wurden, zu denen sich die Patienten nach einer alloHSCT oder nach einer Chemotherapie in einer hämatologischen CR befanden. Bei Patienten nach der alloHSCT (n = 25) konnte eine MRD-Positivität in 16 von 29 (55,1 %; VAF: 0,08–6,7 %) Proben, die zu Zeitpunkten mit normwertigem Spenderchimärismus (> 90 %) entnommen wurden, und in 6 von 6 (100 %; VAF: 0,88–63,77 %) cfDNA-Proben zu Zeitpunkten mit niedrigem Spenderchimärismus nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich auch, dass der Nachweis einer MRD mit einem verkürzten PFS im Vergleich zu Patienten mit einer MRD-Negativität einherging. Bei Patienten, die nur eine Chemotherapie als konsolidierende Therapie erhalten hatten, gelang ein MRD-Nachweis in 4 von 4 (100 %) der CR-Proben (VAF: 0,3–29,84 %) und in 4 von 4 (100 %; VAF: 8,46–100 %) der non-CR-Proben. Hierbei zeigte sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der VAF in cfDNA und der VAF in Referenzproben aus pB bzw. KM (r = 0,8231, p = <0,0001 bzw. r = 0,9370, p = <0,0001). Zusätzlich zu den bekannten Mutationen ließen sich bei insgesamt acht Patienten mit einem Rezidiv im Beobachtungszeitraum nicht vorbeschriebene Mutationen nachweisen, die gegebenenfalls Ausdruck einer klonalen Evolution im Rahmen eines Rezidivgeschehens sein könnten.
Zusammenfassend ist davon auszugehen, dass die MRD-Analyse in der cfDNA mittels NGS eine zuverlässige Detektion einer Rest- beziehungsweise Rezidiverkrankung unterhalb der morphologischen Sensitivitätsschwelle ermöglicht. Zusätzlich erlaubt sie bei Patienten nach alloHSCT eine differenziertere und möglicherweise prognostisch relevante Beurteilung des Remissionsstatus als die Chimärismusanalyse. Eine höhere Sequenziertiefe geht dabei anscheinend mit einer verbesserten Detektionsrate einher, sodass die Sensitivität der Untersuchung durch eine tiefere Sequenzierung zusätzlich verbessert werden kann. Ob eine Therapiesteuerung anhand der Krankheitslast in der cfDNA zu einer Verbesserung des Outcomes von AML-Patienten beitragen kann, war nicht Gegenstand dieser Arbeit. Dies sollte in weiteren Studien evaluiert werden.
The analysis of MRD in AML patients has become increasingly important in the recent years. MRD is defined as persistent leukemic cells under the microscopic detection limit of 5 %. Because evidence of MRD has been shown to be prognostically relevant in several studies, MRD quantification is increasingly being integrated into the clinical management of AML patients. Methods used for MRD quantification usually include highly sensitive molecular methods such as qPCR or NGS which is based on the detection of AML-specific mutations at initial diagnosis and the tracking of mutation load during the course of the disease. The main advantage of NGS is that it doesn’t require mutation-specific reagents and thus enables simultaneous and rapid analysis of multiple AML-associated genes in one assay. Usually, genomic DNA extracted from leukemic cells is used for MRD testing. Another option is using so-called cellfree DNA (cfDNA) which is released during apoptosis and necrosis of cells including tumorous cells (‘liquid biopsy’). The advantage of cfDNA as a sample material, especially from the patient's point of view, is that the cfDNA can be taken via a slightly invasive peripheral blood sample, while a bone marrow puncture is usually a painful and more risky procedure. Since cfDNA is derived from the leukemic cells in the bone marrow (or from extramedullar manifestations), it represents the entire molecular genetic profile of the disease. The aim of this study was to investigate whether cfDNA, as a minimally invasive sample material, is suitable for MRD monitoring using NGS and whether it enables the detection of AML-associated mutations.
For this purpose, a total of 75 cfDNA samples were taken and analyzed from 29 AML patients treated at the UKGM Marburg. The analysis was carried out using a targeted sequencing approach based on two commercially available multi-gene panels that covered 10 or 37 hotspot regions in AML-associated genes (VariantPlex-Core-AML or Core-Myeloid, Archer Dx). The mutation spectrum in the cfDNA samples was compared to the results of the molecular biological analyses carried out in an external reference laboratory as part of routine diagnostics.
Enough cfDNA for a molecular biological analysis could be isolated from all samples, with no significant differences between CR and non-CR samples. The number of reads recommended by the manufacturer (Core AML: 750 000; Core Myeloid: 3 million) was achieved in a total of 48 of 75 (64 %) samples. The sensitivity of mutation detection increased with higher read numbers and mutation-specific sequencing depth (VAF: 0.08–100 %). MRD positivity could be detected in 70.3 % of the CR samples with a sufficient number of reads, but only in 33.3 % of the CR samples with a low number of reads. In the case of non-CR samples, in which the mutation load is expected to be higher, MRD positivity could be demonstrated in all samples even with a low number of reads. The analysis of the cfDNA enabled the detection of at least one known mutation in 32 of 55 (58.2 %; VAF: 0.08–78.04 %) of all cfDNA samples taken at times when the patients were in a hematological CR after alloHSCT or after chemotherapy. In patients after alloHSCT (n = 25), MRD positivity was found in 16 of 29 (55.1 %; VAF: 0.08–6.7 %) samples taken at times with normal donor chimerism (> 90 %) and was detected in 6 out of 6 (100 %; VAF: 0.88–63.77 %) cfDNA samples at time points with low donor chimerism. It was also shown that the detection of an MRD at time points with a normal donor chimerism was accompanied by a shortened PFS compared to patients with MRD negativity. In patients who only received chemotherapy as consolidation therapy, MRD detection was successful in 4 of 4 (100 %) of the CR samples (VAF: 0.3–29.84 %) and in 4 of 4 (100 %; VAF: 8.46–100 %) of the non-CR samples. A positive statistically significant correlation between mutational load in cfDNA and mutational load in reference samples (PB or BM) was observed (r = 0,8231, p = <0,0001 or r = 0,9370, p = <0,0001, respectively). In addition to the known mutations, unknown mutations could be detected in a total of eight patients with a relapse during the observation period, which could possibly contribute to a relapse within the context of a clonal evolution. In view of the results, it can be assumed that MRD analysis in cfDNA using NGS enables reliable detection of residual or recurrent disease below the morphological sensitivity threshold. In addition, it allows a more sensitive assessment of the remission status than the chimerism analysis. A higher sequencing depth is apparently associated with an improved detection rate, so that the sensitivity of the examination can be further improved by deeper sequencing. Whether a therapeutic intervention guided by disease burden as determined in cfDNA can contribute to an improvement of overall survival in AML was not the subject of this work. This should be evaluated in further prospective studies.
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