Characterization of Type IV-A1 CRISPR-interference on gene expression and plasmid replication
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Authors
Publisher
Philipps-Universität Marburg
Abstract
Among the extensive repertoire of bacterial defense mechanisms against mobile genetic elements (MGEs), CRISPR-Cas systems have emerged as versatile tools, primarily relying on nucleases that recognize foreign DNA or RNA. These systems are classified into two classes, seven types, and 33 subtypes based on the composition of the effector complexes involved in the interference process. Since the discovery of CRISPR-Cas systems as adaptive immune systems in bacteria, research has increasingly explored their broader functions beyond immunity against MGEs. One intriguing aspect is the presence of self-targeting spacers (STS) that target functional genes within the host genome, potentially leading to lethal effects. Bacterial cells employ various strategies to mitigate these effects, such as mutations in CRISPR elements, partial complementarity or using anti-CRISPR proteins.
Interestingly, the Type IV-A1 CRISPR-Cas system of Pseudomonas oleovorans contains an STS within its CRISPR array that targets the host pilN gene, which is involved in Type IV pili formation. Notably, this system operates without common mitigation strategies. Instead, the presence of a functional system with a tolerated STS suggests additional functions beyond adaptive immunity.
Type IV systems are typically found on large plasmids and lack adaptation modules like Cas1 and Cas2, as well as nucleases for target degradation. Despite this, they exhibit active defense mechanisms, particularly against plasmids and conjugative elements. Recent studies have highlighted the importance of the helicase-containing protein CasDinG in the interference process. However, the exact interference mechanism and the extent to which the system could be used as a genetic tool remain to be fully elucidated.
In my thesis, I address the characterization of the Type IV-A1 CRISPR ribonucleoprotein (crRNP) interference activities through two main research approaches: characterizing CRISPR interference using Illumina RNA-seq and visualizing crRNP dynamics using single-molecule microscopy (SMM). In Chapter II, we present the first publication on the characterization of the self-targeting activities of the crRNPs in P. oleovorans. My contributions to the study revealed that fluorescently tagged crRNPs displayed distinct dynamics in the presence and absence of the STS, evaluated in both wild-type and ΔCRISPR array strains. In the wild-type strain, significant numbers of confined molecules displayed lower diffusion rates over the bacterial nucleoid, suggesting active nucleoid scanning and probing in the presence of STS. Additionally, comparison of the transcriptomes from the RNA-seq data of wild-type and ΔCRISPR strains showed significant changes in the transcript abundance of the host pilN, with increased transcripts for pilN and neighboring genes in the ΔCRISPR strain. This suggests an interference mechanism that, while tolerating STS, is able to downregulate transcripts while maintaining DNA integrity.
Following these findings, we explored the scope of the interference and potential as a CRISPR interference (CRISPRi) tool in Chapter III. We compared crRNP interference at the transcript level with the well-known dCas9 system, which interferes by physically blocking RNA polymerase (RNAP) and preventing transcription elongation. Targeting different genes in the histidine operon resulted in broader transcriptomic impacts by crRNPs, effectively silencing the entire operon, compared to the local downregulation seen with dCas9 treatments.
In the final part of Chapter III, we evaluated the spatiotemporal dynamics of fluorescently tagged crRNPs in a recombinant system exposed to both genome and target-containing plasmids. Results confirm the distribution of crRNPs over the bacterial nucleoid in presence of genome targets. In contrast, introducing target-containing plasmids redistributed the crRNPs towards cell poles and showed particles with lower diffusion rates, indicating prolonged target interaction times. This supports the hypothesis of crRNP interaction with plasmids. Our findings suggest that crRNPs interfere with plasmid replication by interacting with the replication/transcription machinery, particularly the DnaX clamp loader complex, which was fluorescently tagged to evaluate interactions of crRNPs with replication forks upon plasmid targeting. Experiments showed decreased DnaX diffusion rates in the presence of target-containing plasmids, implying replication fork stalling. This effect aligns with observations in other CRISPR systems and supports the notion of crRNP-mediated plasmid replication inhibition.
Altogether, this research enhances our understanding of Type IV-A1 CRISPR-Cas systems, highlighting their unique interference mechanisms and potential as natural CRISPRi tools. The findings provide a foundation for future studies to explore their broader biological roles and applications in bacterial gene regulation.
Unter den umfangreichen Abwehrmechanismen von Bakterien gegen mobile genetische Elemente (MGEs) haben sich CRISPR-Cas-Systeme als vielseitige Werkzeuge erwiesen, welche hauptsächlich durch Nukleasen fremde DNA oder RNA erkennen. Diese Systeme werden basierend auf der Zusammensetzung der an den Interferenzprozessen beteiligten Effektor-Komplexe in zwei Klassen, sieben Typen und 33 Untertypen unterteilt. Seit der Entdeckung der CRISPR-Cas-Systeme als adaptive Immunsysteme in Bakterien wurden weitere Funktionen jenseits der Immunität gegen MGEs untersucht. Ein faszinierender Aspekt ist das Vorhandensein von Spacern, die funktionale Gene im Wirtsgenom anvisieren und potenziell tödliche Effekte hervorrufen können. Diese werden als self-targeting spacer (STS) bezeichnet. Bakterien verwenden verschiedene Strategien, um STS zu umgehen, wie Mutationen in den CRISPR-Elementen, fehlende Komplementarität oder die Nutzung von Anti-CRISPR-Proteinen.
Interessanterweise enthält das Typ IV-A1 CRISPR-Cas-System von Pseudomonas oleovorans einen STS in seinem CRISPR-Array, der das Wirtsgen pilN anvisiert, welches an der Bildung von Typ IV Pili beteiligt ist. Allerdings verfügt dieses System keine Strategien, um die Effekte des STS zu umgehen. Stattdessen deutet das Vorhandensein eines funktionalen Systems mit einem tolerierten STS auf zusätzliche Funktionen jenseits der adaptiven Immunität hin.
Typ IV-Systeme sind typischerweise auf großen Plasmiden zu finden, wobei Adaptationsproteine wie Cas1 und Cas2, sowie Nukleasen zur Degradation von Ziel-DNA fehlen. Dennoch zeigen Typ IV-Systeme aktive Abwehrmechanismen, insbesondere gegen Plasmide und konjugative Elemente. Die Wichtigkeit der Helikase CasDinG im Interferenzprozess wurde bereits belegt, der genaue Interferenzmechanismus und Anwendungen, in welchen das System als genetisches Werkzeug genutzt werden könnte, müssen jedoch noch vollständig geklärt werden.
In meiner Dissertation beschäftigte ich mich mit der Charakterisierung des Interferenzmechanismus des Typ IV-A1 CRISPR-Ribonukleoproteins (crRNP) mit zwei Hauptforschungsansätzen: die Charakterisierung der CRISPR-Interferenz mittels Illumina RNA-Seq und die Visualisierung der crRNPs mittels single molecule microscopy (SMM). In Kapitel II werden erste Erkenntnisse zur Charakterisierung der Aktivitäten der crRNPs in P. oleovorans gezeigt. Meine Beiträge zu der Studie zeigen, dass fluoreszenzmarkierte crRNPs unterschiedliche Dynamiken in An- und Abwesenheit des STS aufweisen, die sowohl im Wildtyp- als auch im ΔCRISPR-Stamm evaluiert wurden. Im Wildtyp zeigte eine signifikante Anzahl an gebundenen Molekülen niedrigere Diffusionsraten über dem bakteriellen Nukleoid, was auf aktives Scannen des Nukleoids in Anwesenheit des STS hinweist. Zusätzlich zeigte der Vergleich der Transkriptome aus den RNA-Seq-Daten des Wildtyps und ΔCRISPR-Stamms signifikante Änderungen in der Transkriptmenge des Wirtsgens pilN, mit erhöhten Transkripten für pilN und benachbarten Genen im ΔCRISPR-Stamm. Dies deutet auf einen Interferenzmechanismus hin, der trotz Tolerierung des STS in der Lage ist, Transkripte zu regulieren ohne die DNA zu schädigen.
Aufbauend auf diesen Erkenntnissen zeigt Kapitel III das Interferenzpotenzial und die Anwendbarkeit als CRISPR-Interferenz (CRISPRi) Werkzeug. Wir verglichen die crRNP-Interferenz auf Transkriptebene mit dem bekannten dCas9-System, welches durch physische Blockierung der RNA-Polymerase (RNAP) die vollständige Transkription blockiert. Das Targeting verschiedener Gene im Histidin-Operon führte zu erweiterter Reduzierung von Transkripten durch crRNPs, welche zur effektiven Stilllegung des gesamten Operons führte. Experimente mit dCas9 führten hingegen nur zur lokalen Inhibition des Ziels.
Im abschließenden Teil von Kapitel III wird die raumzeitliche Dynamik von fluoreszenzmarkierten crRNPs in einem rekombinanten System gezeigt, das sowohl dem Genom als auch Ziel-Plasmiden ausgesetzt war. Genomziele bestätigten die Verteilung der crRNPs über das bakterielle Nukleoid. Im Gegensatz dazu verteilten sich die crRNPs bei Einführung von Ziel-Plasmiden zu den Zellpolen und zeigten Partikel mit niedrigeren Diffusionsraten, was auf verlängerte Zielinteraktionszeiten hinweist. Dies unterstützt die Hypothese der crRNP-Interaktion mit Plasmiden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass crRNPs mit der Replikations-/Transkriptions-Maschinerie, insbesondere dem sogenannten clamp loader Komplex, interagieren. Hierbei wurde DnaX mit einem Fluoreszenzmarker versehen, um die Interaktionen von crRNPs mit Replikationsgabeln beim Angriff gegen Plasmide zu bewerten. Experimente zeigten verringerte Diffusionsraten von DnaX in Anwesenheit von Ziel-Plasmiden, was auf eine Störung der Replikationsgabel hinweist. Dieser Effekt steht im Einklang mit Beobachtungen in anderen CRISPR-Systemen und unterstützt die Vorstellung einer crRNP-vermittelten Inhibition der Plasmid-Replikation.
Insgesamt erweitert diese Forschung unser Verständnis der Typ IV-A1 CRISPR-Cas-Systeme, hebt ihre einzigartigen Interferenzmechanismen hervor und zeigt ihr Potenzial als natürliche CRISPRi-Werkzeuge. Die Ergebnisse bilden eine Grundlage für zukünftige Studien, die weitere biologische Rollen und Anwendungen des Typ IV-A1 CRISPR-Cas-Systems in der bakteriellen Genregulation untersuchen sollen.