Advancing chloroplast synthetic biology by developing high throughput prototyping capabilities and novel genetic tools
Loading...
Files
Date
Publisher
Philipps-Universität Marburg
Abstract
Climate change poses significant challenges to global agriculture, with rising temperatures, unpredictable weather patterns, and extreme climatic events threatening crop yields. Plant synthetic biology offers promising solutions to enhance the resilience and adaptability of crops to these changing conditions. However, the slow pace of crop engineering, largely due to the inherently slow growth of plants, hinders progress. Currently, the discovery, development, and approval of novel crop traits take approximately 10 to 15 years, with about 4 years dedicated to proof-ofconcept development and optimization of genetic constructs. Chloroplasts present a promising target for introducing novel traits due to their precise DNA integration, absence of gene silencing, ability to stack transgenes in synthetic operons, predictable gene expression outcomes, and reduced risk of transgene escape. Despite their potential, chloroplast biotechnology is still in its early stage, highlighting a desperate need for advanced prototyping capabilities in plant and chloroplast synthetic biology. To advance chloroplast engineering, we have developed a versatile protocol for creating chloroplast-based cell-free gene expression (CFE) systems from various plant species, including wheat (monocot), spinach, and poplar trees (dicots). These systems are compatible with both conventionally used T7 RNA polymerase and endogenous chloroplast polymerases, facilitating detailed characterization and prototyping of regulatory sequences at transcriptional and translational levels. By analyzing a collection of 23 5’ untranslated regions (UTRs), 10 3’ UTRs, and 6 chloroplast promoters in spinach and wheat extracts, we demonstrated consistent expression patterns across species, indicating cross-species compatibility. Recognizing the need for more complex in vivo prototyping, we established Chlamydomonas reinhardtii as a model chassis for chloroplast synthetic biology. Our automated workflow facilitates the generation, handling, and analysis of thousands of transplastomic strains. This included expanding the selection markers, developing new reporter genes, and characterizing over 140 regulatory elements, including native and synthetic promoters, UTRs, and intercistronic elements. We integrated this system with the Phytobrick cloning standard, demonstrating applications a library-based approach to develop synthetic promoter designs in plastids and a chloroplast-based synthetic photorespiration pathway, which resulted in a twofold increase in biomass production. Together, the advancements in chloroplast cell-free systems and the use of Chlamydomonas reinhardtii as a prototyping chassis provide powerful tools for plant synthetic biology. These innovations enhance our ability of engineering gene expression in the chloroplast and support the development of plants designed to meet the demands of a changing global climate.
Der Klimawandel stellt die globale Landwirtschaft vor erhebliche Herausforderungen, da steigende Temperaturen, unvorhersehbare Wetterbedingungen und extreme Klimaereignisse die Ernteerträge bedrohen. Die synthetische Biologie von Pflanzen bietet vielversprechende Lösungen, um die Widerstandsfähigkeit und Anpassungsfähigkeit von Nutzpflanzen an diese veränderten Bedingungen zu verbessern. Allerdings wird der Fortschritt durch das langsame Wachstum der Pflanzen behindert, was das Tempo der Pflanzenentwicklung verlangsamt. Derzeit dauert die Entdeckung, Entwicklung und Zulassung neuer Pflanzeneigenschaften etwa 10 bis 15 Jahre, wobei etwa 4 Jahre für die Entwicklung von den Pflanzenlinien und die Optimierung genetischer Konstrukte aufgewendet werden. Chloroplasten sind ein vielversprechendes Ziel für die Einführung neuer Eigenschaften, da sie eine präzise DNA-Integration, das Fehlen von „Gen silencing“, die Möglichkeit zur Aneinanderreihung von Transgenen in synthetischen Operons, vorhersehbare Genexpressionsmuster und ein geringeres Risiko der TransgenAusbreitung bieten. Trotz ihres Potenzials steckt die Chloroplasten-Biotechnologie noch in einem frühen Entwicklungsstadium, was den dringenden Bedarf an fortgeschrittenen Prototypisierungs-Möglichkeiten in der synthetischen Biologie von Pflanzen und Chloroplasten verdeutlicht. Um die synthetische Biologie im Chloroplasten voranzutreiben, haben wir ein vielseitiges Protokoll zur Erstellung chloroplastenbasierter zellfreier Genexpression (CFE)-Systeme aus verschiedenen Pflanzenarten, einschließlich Weizen (Monokotyledonen), Spinat und Pappeln (Dikotyledonen), entwickelt. Diese Systeme sind sowohl mit der konventionell verwendeten T7-RNA-Polymerase als auch mit endogenen Chloroplasten-Polymerasen kompatibel, was eine detaillierte Charakterisierung und das Prototyping regulatorischer Sequenzen auf Transkriptions- und Translationsebene ermöglicht. Durch die Charakterisierung einer Sammlung von 23 5'-untranslatierten Regionen (UTRs), 10 3'-UTRs und 6 Chloroplasten-Promotoren in Spinat- und Weizenextrakten konnten wir konsistente Expressionsmuster über verschiedene Arten hinweg nachweisen, was auf eine artenübergreifende Kompatibilität hinweist. Angesichts des Bedarfs an komplexerem in vivo-Prototyping haben wir Chlamydomonas reinhardtii als Modellchassis für die synthetische Biologie im Chloroplasten etabliert. Unser automatisierter Workflow ermöglicht die Erzeugung, Handhabung und Analyse von Tausenden transplastomischer Stämme. Dies umfasste die Erweiterung der Selektionsmarker, die Entwicklung neuer Reportergene und die Charakterisierung von über 140 regulatorischen Elementen, einschließlich nativer und synthetischer Promotoren, UTRs und intercistronischer Elemente. Unser System folgt hier dem Phytobrick Klonierungsstandard und wir konnten für all diese Werkzeuge Anwendungen demonstrieren, wie einen sequenz-bibliotheksbasierten Ansatz zur Entwicklung synthetischer Promotor-Designs in Plastiden sowie einen Chloroplasten basierten synthetischen Photorespirationsweg, der zu einer Verdopplung der Biomasseproduktion führte. Zusammen bieten die Fortschritte in chloroplastenbasierten zellfreien Systemen und die Nutzung von Chlamydomonas reinhardtii als Prototyping-Chassis leistungsstarke Werkzeuge für die synthetische Biologie der Pflanze. Diese Innovationen verbessern unsere Fähigkeit zur Regulation der Genexpression im Chloroplasten und unterstützen die Entwicklung von Pflanzen, die den Anforderungen eines sich wandelnden globalen Klimas gerecht werden.
Review
Metadata
License
Except where otherwised noted, this item's license is described as Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 - CC BY NC ND