Secretion processes as a limiting factor of protein production in Bacillus
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Authors
Publisher
Philipps-Universität Marburg
Abstract
Summary
Protein secretion involves several important sequential steps. First, proteins to be secreted must be
recognized and their translocation-competent conformation must be ensured. This is followed by the
overcoming of two barriers, the cell membrane and the cell wall. The active transport across the
membrane can occur by several well-studied mechanisms, the most notably of them are known as
"general secretory" (Sec) and "twin-arginine translocation" (Tat). For the passage through the cell
wall, on the other hand, understanding is still almost completely lacking.
In this work, I investigated this process, using super-resolution fluorescence microscopy to visualize
AmyE-mCherry during secretion in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis. The overexpressed
fusion protein localized as distinct foci in the cell envelope, which were mostly lost upon degradation
of the bacterial cell wall through treatment with lysozyme. I could also show that AmyE is released
from the cells at discrete zones, similar to the localization of fluorescently labeled AmyE as foci
inside the envelope. High-level protein secretion peaked at the transition from exponential growth
to the stationary phase and appears to be restricted to a subpopulation of cells, which presumably is
also the case for general protein secretion. Time lapse experiments revealed the AmyE-mCherry foci
to be statically positioned throughout several minutes, in contrast to the lateral mobility of Secmachinery
associated membrane proteins SecA and SecDF, labeled with mNeonGreen.
Interestingly, the AmyE-mCherry foci displayed considerable fluctuations of fluorescence
intensities within a minutes-time-scale, suggesting visualized diffusion of proteins along the passage
through the cell walls meshwork. This idea of diffusion is supported by recent AFM Imaging results
of B. subtilis, revealing a heterologous cell wall structure with deep pores its peptidoglycan surface.
For large parts of industrial biotechnology, the secretion of microbially produced enzymes and
proteins into the culture supernatant is of enormous relevance, due to the lower costs for subsequent
processing associated with this method as compared to the disruption of the producing cells. Studies
investigating secretion efficiency in Bacillus species, have revealed numerous influencing factors.
Since the bacterial cell wall is often overlooked in the search for secretion bottlenecks, I targeted
autolysins that can affect cell wall thickness and the density of the meshwork. While absence of
LytD had little effect on secretion, deletion of lytC and lytF significantly impaired AmyE transport
to the outside of the cell. By introducing additional genes encoding the autolysins LytC and LytF or
the cell wall hydrolase PBP5 (dacA), I was able to improve secretion by up to 200%. These findings
suggest that cell wall permeability for secreted proteins is modulated by autolysin activity.
Flotillins, which are thought to form functional membrane microdomains (FMM) in B. subtilis, are
often linked with secretion, although the nature of this connection is not exactly clear. To approach
this subject, I used a ΔyuaG (FloT) deletion strain with reduced AmyE secretion and showed that
the addition of the membrane fluidizer benzyl alcohol could recover the AmyE secretion level of the
wild type. This result indicates, that flotillins affect protein secretion in B. subtilis through the ability
to improve membrane fluidity. Furthermore, I was able to double the efficiency of AmyE secretion
of B. subtilis by introducing an additional gene encoding FloT.
Zusammenfassung
Die Proteinsekretion umfasst mehrere wichtige aufeinander folgende Schritte. Zunächst müssen die
zu sekretierenden Proteine erkannt und ihre translokations-kompetente Konformation gewährleistet
werden. Danach müssen zwei Barrieren überwunden werden, die Zellmembran und die Zellwand.
Der aktive Transport durch die Membran kann durch mehrere gut untersuchte Mechanismen
erfolgen, insbesondere durch den sogenannten "general secretory" (Sec) und den "twin-arginine
translocation" (Tat). Für die Passage durch die Zellwand hingegen fehlt das Verständnis noch fast
vollständig.
In dieser Arbeit untersuchte ich diesen Prozess in Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis, indem
ich AmyE-mCherry während der Sekretion, mittels superhochauflösender Fluoreszenzmikroskopie,
sichtbar machte. Das überproduzierte Fusionsprotein lokalisierte als deutliche Foci in
der Zellhülle, welche beim Abbau der bakteriellen Zellwand, durch Behandlung mit Lysozym,
größtenteils verloren gingen. Ich konnte zeigen, dass AmyE an bestimmten Zonen aus den Zellen
freigesetzt wird, die Ähnlichkeit zu den Foci von fluoreszenzmarkiertem AmyE in der Hülle
aufweisen. Die hochperformante Proteinsekretion erreichte ihren Höhepunkt beim Übergang vom
exponentiellen Wachstum zur stationären Phase und scheint auf eine Teilpopulation von Zellen
beschränkt zu sein, was vermutlich auch für die native Proteinsekretion zutrifft.
Zeitrafferexperimente zeigten, dass die AmyE-mCherry-Foci über mehrere Minuten hinweg statisch
fixiert blieben, im Gegensatz zur hohen lateralen Mobilität der Sec-Maschinen-assoziierten
Membranproteine SecA und SecDF, die mit mNeonGreen markierten wurden. Interessanterweise
zeigten die AmyE-mCherry-Foci erhebliche Fluoreszenzintensitätsschwankungen innerhalb von
Minuten, was auf eine sichtbare Diffusion des Proteins entlang der Passage durch die
Zellwandmatrix hindurch schließen lässt. Diese Annahme von Diffusion wird durch jüngste AFMImaging-
Ergebnisse von B. subtilis unterstützt, die eine heterologe Zellwandstruktur mit tiefen
Poren in der Oberfläche des Peptidoglykans zeigen.
Für weite Teile der industriellen Biotechnologie ist die Sekretion von mikrobiell produzierten
Enzymen und Proteinen in den Kulturüberstand von enormer Bedeutung, da diese Methode im
Gegensatz zum Aufschluss der produzierenden Zellen, mit geringeren Kosten für die
Weiterverarbeitung verbunden ist. Untersuchungen zur Sekretionseffizienz bei Bacillus-Vertretern
haben zahlreiche Einflussfaktoren enthüllt.
Da die bakterielle Zellwand bei der Suche nach Sekretionsengpässen oft übersehen wird, habe ich
mich auf Autolysine konzentriert, welche die Zellwanddicke und die Dichte des Maschenwerks
beeinflussen können. Während das Fehlen von LytD nur geringe Auswirkungen auf die Sekretion
hatte, beeinträchtigte die Deletion von LytC und LytF den Transport von AmyE in die Umgebung
der Zelle erheblich. Durch die Einführung zusätzlicher Gene, die für die Autolysine LytC und LytF
oder die Zellwandhydrolase PBP5 (dacA) kodieren, konnte ich die Sekretion um bis zu 200%
verbessern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Durchlässigkeit der Zellwand für
sekretierte Proteine durch die Autolysin-Aktivität moduliert wird.
Flotilline, von denen man annimmt, dass sie in B. subtilis funktionelle Membranmikrodomänen
(FMM) bilden, werden oft mit der Sekretion in Verbindung gebracht, obwohl die Art dieser
Verbindung noch unklar ist. Um sich diesem Thema zu nähern, habe ich einen ΔyuaG (FloT)-
Deletionsstamm mit verminderter AmyE-Sekretion verwendet und konnte zeigen, dass die Zugabe
des Membranfluidisators Benzylalkohol, das Wildtyp-Sekretionsniveau wiederherstellen kann.
Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Flotilline die Proteinsekretion in B. subtilis durch ihre
Fähigkeit zur Verbesserung der Membranfluidität beeinflussen. Außerdem konnte ich die Effizienz
der AmyE-Sekretion von B. subtilis verdoppeln, indem ich ein zusätzliches Gen einführte, das für
FloT kodiert.