Bedeutung des IL-6-Transsignalings für die vaskuläre Inflammation: Untersuchung des antiinflammatorischen Potentials von sgp130Fc an humanen Zellen
Loading...
Files
Date
Authors
Publisher
Philipps-Universität Marburg
Abstract
Kardiovaskuläre Erkrankungen, insbesondere Herzinfarkte und Schlaganfälle, sind schwerwiegende Folgen der Atherosklerose und zählen zu den weltweit führenden Todesursachen. Atherosklerose ist ein chronisch-entzündlicher Prozess der Gefäßwand, an dem das IL-6-Transsignaling maßgeblich beteiligt ist. IL-6 verfügt über einen dualen Signalweg, wobei das klassische Signaling über einen membranständigen IL-6R unter Rekrutierung zweier gp130-Moleküle auf der Zelloberfläche vermittelt wird, während beim Transsignaling IL-6 zunächst an die lösliche Form seines Rezeptors, den sIL-6R, bindet und dann mit dem ubiquitär vorkommenden gp130 auf der Zelloberfläche interagiert. Während das klassische Signaling u.a. die Akute-Phase-Reaktion in der Leber bei der akuten Infektabwehr vermittelt, wird das IL-6-Transsignaling vorwiegend mit chronischen Entzündungprozessen in Verbindung gebracht. Die globale Hemmung beider IL-6-Signalwege führt zu einer mitunter lebensbedrohlichen Schwächung der Immunabwehr, sodass die gezielte Hemmung des IL-6-Transsignalings bei der Therapie chronisch-entzündlicher Erkrankungen einen vielversprechenden und nebenwirkungsärmeren Ansatz darstellt. Der IL-6-Transsignaling-Inhibitor sgp130Fc ist in der Lage, Komplexe aus IL-6 und dem sIL-6R zu binden und somit gezielt das IL-6-Transsignaling zu hemmen. Unter dem Handelsnamen Olamkicept wird der optimierte Wirkstoff derzeit in klinischen Studien der Phase II für die Anwendung bei CEDs erforscht. Im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass sgp130Fc die arterielle Plaqueentstehung verringern kann. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die in vitro-Testung von sgp130Fc an humanen Zellen, die maßgeblich an der Atherogenese beteiligt sind. Ausgewählt wurden ECs, SMCs und Fibroblasten der humanen Gefäßwand sowie die Monozyten-Zelllinie U937 und primär isolierte humane Monozyten. Untersucht wurde die Hemmbarkeit einer durch IL-6 induzierten STAT3-Phosphorylierung durch sgp130Fc. Die Induktion von p-STAT3 und deren Hemmung durch sgp130Fc wurde mithilfe von Western Blots nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass sich ECs, SMCs und Fibroblasten direkt mit IL-6 stimulieren lassen und STAT3 phosphorylieren, obwohl im Allgemeinen davon ausgegangen wird, dass diese Zellen keinen membranständigen IL-6R besitzen, sondern darauf angewiesen sind, dass beispielsweise Immunzellen den sIL-6R zur Verfügung stellen. Das so induzierte p-STAT3-Signal ließ sich in den Zellen der Gefäßwand durch sgp130Fc nicht hemmen, was ein weiteres Indiz für das Vorliegen von klassischem IL-6-Signaling in diesen Zellen darstellt. Die Stimulationsversuche wurden mit Hyper-IL-6 wiederholt, einem Fusionsmolekül aus IL-6 und dem sIL-6R, um die Gefäßwandzellen gezielt über das Transsignaling zu stimulieren. Das so erzeugte p-STAT3-Signal konnte durch sgp130Fc erfolgreich gehemmt werden. Bezüglich der Monozyten ist bekannt, dass diese beide IL-6-Signalwege nutzen können, was auch in dieser Arbeit bestätigt werden konnte. Der Versuch, durch IL-6-Transsignaling die Migration von Monozyten auszulösen, gelang nicht, sodass eine mögliche Hemmung durch sgp130Fc nicht untersucht werden konnte. Im Rahmen eines Proteinarrays konnte nachgewiesen werden, dass durch IL-6-Transsignaling die Produktion von IL-6 und IL-7 in ECs induziert wird und dieser Effekt durch sgp130Fc hemmbar ist.
Der Nachweis des membranständigen IL-6R im Western Blot gelang nur in Monozyten, jedoch nicht in den Gefäßwandzellen, was auf eine kontextabhängige Expression des Rezeptors in somatischen Zellen hindeutet. Der sIL-6R konnte im ELISA außer in Monozyten nur in ECs nachgewiesen werden, allerdings in bedeutend geringerem Ausmaß. In der RT-PCR gelang hingegen der Nachweis von mRNA für den IL-6R in sämtlichen untersuchten Zellen.
Die vorliegende Arbeit weist somit nach, dass das IL-6-Transsignaling in Zellen der humanen Gefäßwand durch sgp130Fc erfolgreich gehemmt werden kann. Da das IL-6-Transsignaling maßgeblich an der Entstehung von Atherosklerose beteiligt ist, erscheint daher ein zukünftiger Einsatz von sgp130Fc, bzw. Olamkicept, als innovative Behandlungsmöglichkeit für Atherosklerose vorstellbar. Ein erster Behandlungsversuch mit Olamkicept im Rahmen einer Fallstudie, an der unsere Arbeitsgruppe beteiligt war, deutet in diese Richtung.
Cardiovascular diseases, particularly myocardial infarction and stroke, are se-vere complications of atherosclerosis and are among the leading causes of death worldwide. Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of the arte-rial vessel wall, in which IL-6-transsignaling plays a major role. IL-6 has a dual signaling pathway, with classic signaling being mediated via a membrane-bound IL-6R and requiring the recruitment of two molecules of gp130 on the cell surface. In transsignaling however, IL-6 binds to its soluble receptor (sIL-6R) first, and then interacts with the ubiquitously expressed gp130 on the cell surface. Whereas classic signaling, among other functions, is known to medi-ate the acute phase response in the liver, IL-6-transsignaling seems to be mainly responsible for chronic inflammatory processes. Global inhibition of both pathways leads to a sometimes lethal suppression of the immune system, which is why the specific inhibition of transsignaling seems to be a promising new approach in the treatment of chronic inflammatory diseases, with fewer side effects. The IL-6-transsignaling inhibitor sgp130Fc binds complexes of IL-6 and the sIL-6R, thus specifically inhibiting IL-6-transsignaling. Under the trade name of Olamkicept, optimized sgp130Fc is currently being tested in phase II clinical trials for use in inflammatory bowel disease. It has been shown that sgp130Fc can diminish atherogenesis in mice. This work explored the in vitro effects of sgp130Fc on such human cells that are known to play a major role in atherogenesis. ECs, SMCs and fibroblasts of the human vascular wall were chosen for testing, as well as monocytic cell line U937 and primary monocytes. We examined the ability of sgp130Fc to inhibit the phosphorylation of STAT3 induced by IL.6. The induction of p-STAT3 and its inhibition by sgp130Fc were detected using Western blots. It was shown that ECs, SMCs and fibroblasts can be stimulated directly with IL-6 and thus phosphorylate STAT3, although it is commonly thought that those cells do not express the membrane-bound IL-6R, but depend on immune cells to provide the sIL-6R for them. Sgp130Fc was unable to inhibit the p-STAT3 signal induced by IL-6, fur-ther pointing towards classic signaling in the cells of the human vascular wall. Stimulation was repeated with Hyper-IL-6, a fusion protein of IL-6 and the sIL-6R, in order to specifically induce IL-6-transsignaling in the cells of the vascu-lar wall. This time, p-STAT3 was successfully inhibited by sgp130Fc. It is known that monocytes use both classic and transsignaling, which was further underlined in this work. In a migration assay, IL-6-transsignaling was not suffi-cient to stimulate monocytes to migrate; therefore, an inhibitory effect of sgp130Fc on cell migration could not be examined. It could be shown in a pro-tein array that IL-6-transsignaling increases the expression of IL-6 and IL-7 in ECs and that sgp130Fc inhibits that effect.
In Western blot experiments, the membrane-bound IL-6R was only found in monocytes, but not in the cells of the vascular wall, which points towards a context dependent expression of the receptor in somatic cells. The sIL-6R was found by ELISA in the cell supernatant of monocytes and ECs exclusively, with the ECs producing considerably less of the receptor than monocytes. RT-PCR showed mRNA expression for the IL-6R in all cells examined.
To conclude, this work proves that IL-6-transsignaling in cells of the human vascular wall can be successfully inhibited by sgp130Fc. As IL-6-transsignaling plays a major role in atherogenesis, sgp130Fc (or Olamkicept) may become an innovative treatment for atherosclerosis in the future. A case study, in which our group was involved, has shown promising results.
Review
Metadata
License
This item has been published with the following license: In Copyright