Mapping of the differential exchange & dynamics of type IVa pilus machine components: Implications for function
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Authors
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Large multiprotein complexes perform various biological processes. In the past decade, in vivo fluorescence labeling of proteins and advanced microscopy techniques have revealed that many protein complexes, previously assumed to be static, contain components that dynamically exchange subunits with cellular pools. The type IVa pilus machine (T4aPM) drives the extension/adhesion/retraction cycles of T4aP and is the prototype of a large family of prokaryotic cell envelope-spanning macromolecular complexes involved in motility, DNA-uptake, secretion, and adhesion. Here, we used the T4aPM in Myxococcus xanthus as a model to investigate whether proteins of this nano-machine dynamically exchange and if exchange is coupled to the activity of the T4aPM. We performed Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments on live cells, in which selected fluorescently-tagged proteins of the T4aPM were synthesized at close to native levels. We demonstrate different dynamics for individual components of the T4aPM. The PilQ secretin and its associated periplasmic protein TsaP, that jointly form the outer membrane (OM) pore, as well as the inner membrane (IM) proteins PilP and PilO, and likely also the IM protein PilN, that jointly form the alignment complex connecting the outer OM pore to the IM platform protein PilC, were stably incorporated into the T4aPM. By contrast, the three cytoplasmic proteins PilM, PilB and PilT were dynamically incorporated into the T4aPM and displayed different exchange kinetics. In the case of PilM, the exchange rate was dependent on the functional state of the T4aPM and were reduced by binding of the extension and retraction ATPases, PilB and PilT, to the base of the T4aPM. Remarkably, using an active variant of the PilM that was stably incorporated into the T4aPM, we demonstrate that PilM exchange is not essential for T4aPM function. The ATPases PilB and PilT underwent rapid exchange; however, PilB exchange was much faster than PilT exchange, supporting that the rate of T4aP formation is limited by slow PilT unbinding from the T4aPM. The different exchange kinetics of PilM, PilB and PilT support that they exchange independently of each other. Moreover, our data support that the dynamic exchange of PilB and PilT reflect neither the incorporation of the hundreds of individual PilA building block of the T4aP per second into the extending pilus nor their removal during retractions, and that the PilA subunits are delivered and removed to the T4aPM independently of any T4aPM component. We conclude that the trans-envelope structural elements of the T4aPM are stable structures once assembled, that the only dynamically incorporated proteins are the cytoplasmic PilM, PilB and PilT, with PilM exchange not being important for T4aPM function, while PilB and PilT exchange reflects the binding and unbinding of these proteins to the T4aPM to power T4aP extension and retraction, respectively.
The second part of this study focus on SgmO, a regulator of exopolysaccharide synthesis. Detailed genetic analyses confirmed that SgmO is important for exopolysaccharide synthesis, T4aP-dependent motility, and development. Moreover, ΔsgmO cells had reduced T4aP levels.
Große Multiprotein-Komplexe führen unterschiedliche biologische Prozesse aus. In den letzten zehn Jahren haben in-vivo-Fluoreszenzmarkierung von Proteinen und hochentwickelte Mikroskopie Techniken gezeigt, dass viele Protein-Komplexe, die zuvor als statisch angesehen wurden, Komponenten enthalten, die sich dynamisch mit zellulären Proteinen austauschen. Die Typ-IVa-Pilus-Maschine (T4aPM) treibt die Verlängerungs-/Haftungs-/Rückzugszyklen von T4aP an und ist ein Prototyp einer großen Familie prokaryotischer, die Zellhülle durchspannender makromolekularer Komplexe, die an Bewegung, DNA-Aufnahme, Sekretion und Haftung beteiligt sind. Hier haben wir die T4aPM in Myxococcus xanthus als Modell verwendet, um zu untersuchen, ob Proteine dieser Nanomaschine dynamisch ausgetauscht werden und ob der Austausch mit der Aktivität der T4aPM gekoppelt ist. Wir führten Fluoreszenz-Recovery-after-Photobleaching (FRAP)-Experimente an lebenden Zellen durch, in welchen ausgewählte fluoreszenzmarkierte Proteine der T4aPM auf einem nahezu nativen Level synthetisiert wurden. Wir zeigen unterschiedliche Dynamiken für individuelle Komponenten der T4aPM. Das PilQ-Secretin und das assoziierte periplasmatische Protein TsaP, die gemeinsam die äußere Membranpore bilden, sowie die innere Membran (IM) Proteine PilP und PilO und wahrscheinlich auch das IM-Protein PilN, die gemeinsam den Alignment-komplex bilden, welcher die äußere Membran Pore mit dem IM-Plattformprotein PilC verbindet, wurden stabil in die T4aPM eingebaut. Im Gegensatz dazu wurden die drei zytoplasmatischen Proteine PilM, PilB und PilT dynamisch in die T4aPM eingebaut und zeigten unterschiedliche Austauschkinetiken. Im Fall von PilM war die Austauschrate abhängig vom funktionellen Zustand der T4aPM und wurde durch die Bindung der Verlängerungs- und Rückzugs-ATPasen PilB und PilT an der Basis der T4aPM reduziert. Bemerkenswert ist, dass wir mithilfe einer aktiven Variante von PilM, die fest in die T4aPM eingebaut war, zeigen, dass der Austausch von PilM für die Funktion der T4aPM nicht entscheidend ist. Die ATPasen PilB und PilT unterlagen einem schnellen Austausch; jedoch war der Austausch von PilB wesentlich schneller als der von PilT, was darauf hinweist, dass die Geschwindigkeit der T4aP-Bildung durch das langsame Lösen von PilT von der T4aPM begrenzt ist. Die unterschiedlichen Austauschkinetiken von PilM, PilB und PilT unterstützen die These, dass sie unabhängig voneinander ausgetauscht werden. Darüber hinaus stützen unsere Daten die Annahme, dass der dynamische Austausch von PilB und PilT weder die Aufnahme der Hunderte von einzelnen PilA-Bausteinen pro Sekunde in den wachsenden Pilus noch deren Entfernung während des Rückzugs widerspiegelt, und dass die PilA-Untereinheiten unabhängig von jeder T4aPM-Komponente zur T4aPM transportiert und entfernt werden. Wir schließen daraus, dass die Zellhülle durchspannenden strukturellen Elemente der T4aPM stabile Strukturen sind, sobald sie zusammengebaut sind, und dass die einzigen dynamisch eingebauten Proteine die zytoplasmatischen PilM, PilB und PilT sind, wobei der Austausch von PilM für die Funktion der T4aPM nicht wichtig ist, während der Austausch von PilB und PilT das An- und Abbinden dieser Proteine an die T4aPM zur Verlängerung bzw. zum Rückzug der T4aP reflektiert.
Der zweite Teil dieser Studie konzentriert sich auf SgmO, einen Regulator der Exopolysaccharidsynthese. Detaillierte genetische Analysen bestätigten, dass SgmO wichtig für die Exopolysaccharidsynthese, die T4aP-abhängige Beweglichkeit und die Entwicklung ist. Außerdem hatten ΔsgmO-Zellen reduzierte T4aP-Spiegel.