Aus dem Med. Zentrum für Operative Medizin Klinik für Neurochirurgie Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Christopher Nimsky des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg Hat intrathekal appliziertes Baclofen (Lioresal®) einen neuroprotektiven Effekt im 4-Gefäßverschlussmodell der Ratte? Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin dem Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Florian Michael Stubenvoll aus Idar-Oberstein Marburg 2015 Originaldokument gespeichert auf dem Publikationsserver der Philipps-Universität Marburg http://archiv.ub.uni-marburg.de Dieses Werk bzw. Inhalt steht unter einer Creative Commons Namensnennung Keine kommerzielle Nutzung Weitergabe unter gleichen Bedingungen 3.0 Deutschland Lizenz. Die vollständige Lizenz finden Sie unter: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/de/ 2 Meiner Familie 3 1 EINLEITUNG ................................................................................................. 6 1.1 Ischämiemodelle bei Ratten ............................................................................................................. 8 1.2 Schädigungsmuster globaler ischämischer zerebraler Läsionen ................................................. 9 1.3 Biochemische Vorgänge periischämisch ...................................................................................... 11 1.4 Baclofen und der GABA-Rezeptor ............................................................................................... 14 1.4.1 Substanz ................................................................................................................................... 14 1.4.2 Pharmakokinetik ...................................................................................................................... 14 1.4.3 Der GABA-Rezeptor ................................................................................................................ 15 1.5 Fragestellungen ............................................................................................................................... 16 2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................... 17 2.1 Materialien ...................................................................................................................................... 17 2.1.1 Tiere und Tierhaltung ............................................................................................................... 17 2.1.2 Materialien für Globalischämie ............................................................................................... 17 2.1.3 Materialien für die stereotaktische Zielpunktbestimmung und für die Injektion ..................... 20 2.1.4 Materialien zur Messung von Vital- und Laborparametern ..................................................... 21 2.1.5 Materialien zur In-vivo-Fixierung des Rattenhirns .................................................................. 21 2.1.6 Materialien zur histologischen Aufarbeitung der Gehirne ....................................................... 22 2.1.7 Materialien zur Quantifizierung der hippokampalen Läsion ................................................... 23 2.2 Methoden ......................................................................................................................................... 23 2.2.1 Operationsvorbereitung ........................................................................................................... 23 2.2.2 Durchführung der Globalischämie ........................................................................................... 25 2.2.2.1 Legen eines arteriellen Zuganges ..................................................................................... 25 2.2.2.2 Präparation der hirnversorgenden Arterien ...................................................................... 28 2.2.2.3 Induktion der reversiblen zerebralen Globalischämie ..................................................... 32 2.2.3 Stereotaktische intrazerebroventrikuläre Applikation von Baclofen ....................................... 33 2.2.3.1 Stereotaktische Zielpunktbestimmung bei der Ratte ....................................................... 33 2.2.3.2 Beschreibung der Applikationsvorrichtung ..................................................................... 35 2.2.3.3 Applikation von Baclofen ................................................................................................ 35 2.2.4 Messung der Vital- und Laborparameter und Überwachung ................................................... 36 2.2.5 In-vivo-Fixierung der Ratte ..................................................................................................... 40 2.2.6 Mikroskopie des Gehirns ........................................................................................................ 41 2.2.6.1 Durchführung der histologischen Aufarbeitung des Gehirns ......................................... 41 2.2.6.2 Histologische Schnitte der Hippokampusregion .............................................................. 42 2.2.6.3 Säurefuchsin-Cölestinblau-Färbung ................................................................................ 42 2.2.7 Quantifizierung der Läsion ...................................................................................................... 46 4 2.2.8 Statistik ..................................................................................................................................... 48 3 RESULTATE ............................................................................................... 49 3.1 Zellläsionen ..................................................................................................................................... 49 3.2 Mittlerer arterieller Blutdruck (Mean arterial blood pressure, MABP) .................................. 55 3.3 Rektaltemperatur ........................................................................................................................... 72 3.4 Intrakranielle Temperatur ............................................................................................................ 74 3.5 Blutglukosespiegel aus der Femoralarterie .................................................................................. 76 3.6 Kohlendioxid-Partialdruck (pCO2) .............................................................................................. 85 3.7 Sauerstoff-Partialdruck (pO2) ...................................................................................................... 93 3.8 pH ................................................................................................................................................... 100 3.9 Zusammenfassung der Ergebnisse ............................................................................................. 103 4 DISKUSSION ........................................................................................... 105 4.1 Wahl der Versuchstiere ............................................................................................................... 105 4.2 Operationstechnik ........................................................................................................................ 106 4.2.1 Anästhesie .............................................................................................................................. 106 4.2.2 Intraoperativer Blutverlust und Flüssigkeitshaushalt ............................................................. 106 4.2.3 Rektaltemperatur / Intrakranielle Temperatur ........................................................................ 107 4.2.4 Glukosehaushalt ..................................................................................................................... 108 4.2.5 Blutgase .................................................................................................................................. 108 4.3 Wirkungsweise von Baclofen ....................................................................................................... 111 4.4 Interpretation der Ergebnisse ..................................................................................................... 112 5 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................ 115 6 LITERATURVERZEICHNIS, CHRONOLOGISCH ................................... 117 7 LITERATURVERZEICHNIS, ALPHABETISCH ....................................... 125 8 ANHANG ................................................................................................... 132 5 8.1 Abkürzungen ................................................................................................................................ 132 8.2 Danksagung ................................................................................................................................... 134 8.3 Akademische Lehrerinnen und Lehrer ...................................................................................... 136 6 1 Einleitung Baclofen wird als Lioresal® intrathekal im klinischen Gebrauch zur Therapie der spinalen und auch supraspinalen Spastik seit 1984 eingesetzt. Diese kann die Folge eines schweren Schädelhirntraumas, eines Tumors, einer Blutung, eines ischämischen Ereignisses oder einer Multiplen Sklerose im zentralen Nervensystem sein. Es ist wahrscheinlich, dass Baclofen ebenfalls einen analgetischen Effekt besitzt, zumindest jedoch scheint es bei supraspinalen Spastiken die autonomen Dysregulationen zu verbessern [1]. Es konnte beobachtet werden, dass Patienten, denen dieses Pharmakon über eine implantierbare Medikamentenpumpe intrathekal appliziert wurde, in einer Weise profitierten, die über die Spasmolyse oder Analgesie hinausgeht: Neben einer Reduzierung der Spastik sowie der durch die Spastik verursachten Schmerzen, war auch eine positive Beeinflussung vegetativer Regulationsstörungen zu verzeichnen [2]. Der Frage, ob Baclofen einen neuroprotektiven Effekt hat, ist bislang nur bei der systemischen Applikationsform nachgegangen worden. Daten zur intrathekalen Applikationsweise lassen sich vermissen [3]. Es soll ein Beitrag geleistet werden zu ergründen, ob Baclofen eine neuroprotektive Potenz bei intrakthekaler Applikation besitzt. Diese Annahme ist nahe liegend, da Baclofen, als GABAB-Agonist hemmend auf die Freisetzung exzitatorischer Neurotransmitter, allen voran Glutamat, wirkt. Diese entstehen bei Schädigungen des zentralen Nervensystems sowie bei vegetativen Krisen. Im Rahmen der weiter unten erläuterten Exzitotoxizität kommt diesen Neurotransmittern eine große Bedeutung beim neuronalen Zelltod zu. Aus Untersuchungen einer Habilitationsarbeit von Ralf Becker und einer Promotionsarbeit von Alexander Ludolph, die bei postischämischer 7 Applikation von 1,5µg Baclofen keinen Anhalt auf Wirksamkeit gefunden, und bei der präischämischen Applikation mit 1,5µg sogar auf Grund der Kardiodepression einen schädigenden Effekt beobachtet [4] haben, ergeben sich weitere Fragestellungen. Die Überlegung ist nun, mit einer niedrigeren Dosierung präischämisch (1µg) die der Ischämie aufgesetzte zusätzlich schädigende Wirkung der Kardiodepression, die eine intraischämischen Minderperfusion hervorrufen kann, bis zu einem gewissen Grad zu vermindern, und postischämisch durch eine höhere Dosierung (2µg) doch noch einen neuroprotektiven Effekt zu demaskieren [4]. In einer Arbeit aus dem Jahre 1990 wurde bereits der Schluss gezogen, dass Baclofen, intraperitoneal appliziert, keinen neuroprotektiven Effekt habe: Unter der Annahme, dass eine präsynaptische Glutamatfreisetzung in den extrazellulären Raum und eine Aktivierung der rezeptorvermittelten Ca2+-Kanäle am ischämieinduzierten neuronalen Schaden beteiligt seien - das ist eine These der Exzitotoxizitätstheorie, die später weiter ausgeführt wird - wurde der GABAB-Rezeptor-Agonist Baclofen als potenziell wirksames Pharmakon untersucht, welches inhibierend auf den Ca2+-Influx wirkt. Es wurden 10mg/kg KG Baclofen 1 Stunde vor und 30 bis 60 Minuten nach einem 20-minütigen Viergefäßverschluss bei 64 Wistar-Ratten i. p. appliziert und die Mortalität, das Arbeitsgedächtnis und der hippokampale resp. kortikale Zellschaden nachuntersucht. Bei dieser prä- und postischämischen intraperitonealen und somit systemischen Applikation hat sich kein Benefit durch Baclofen nachweisen lassen [5]. Die vorliegende Arbeit versucht jedoch zu zeigen, dass beide Applikationszeitpunkte getrennt voneinander zu betrachten sind. Die Verläufe der Blutdruckkurven, die maßgeblich von der Baclofenapplikation beeinflusst werden, spielen möglicherweise eine 8 erhebliche Rolle bei der Evaluation der Wirksamkeiten des Pharmakons. Außerdem wird hier die intrathekale im Gegensatz zur systemischen Applikation gewählt. 1.1 Ischämiemodelle bei Ratten Bei den meisten kleinen Labortieren, so auch bei den hier verwendeten männlichen Wistar-Ratten, ist der unilaterale Verschluss einer A. carotis communis wenig schädlich [6]. Bereits 1979 beschreiben Pulsinelli und Brierley ein Viergefäßverschlussmodell zur globalen Ischämie, bei dem die Vertebralarterien in Höhe des ersten Halswirbelkörpers vermittels eines Elektrokauters durch die Foramina alaria permanent unterbrochen werden und die Aa. carotides communes temporär durch einen Klip verschlossen werden [7]. Der sechs Jahre später vorgestellte Dreigefäßverschluss, bei dem das hintere Stromgebiet weiter kranial in Höhe der A. basilaris unterbrochen wird, vermag keine Verbesserung gegenüber dem Viergefäßverschlussmodell aufzuzeigen [8]. 1988 erweitert Pulsinelli die Beschreibung seines Viergefäßverschlussmodells auf die Beherrschung von Kollateralkreisläufen. Diese stellen einen nicht zu unterschätzenden Einfluss bei der globalen zerebralen Ischämie dar, können sie doch die totale Flussunterbrechung bis zu einem ungewissen Grade vereiteln [9]. Denkbar wäre eine Untersuchung des Restflusses mit einem transkraniellen Laserdopplerverfahren. In einem 1989 veröffentlichen Review werden die verschiedenen Ischämiemodelle bei Nagetieren einander gegenübergestellt, wobei die Indikationen sehr gewissenhaft abgegrenzt sind [10]. 9 So eignet sich zur Untersuchung fokaler ischämischer Läsionen ein Verschlussmodell der A. cerebri media besser, bei dem ein Nylon- Faden einer bestimmten Dicke intraluminal vorgeschoben wird und das Gefäß distal vom Fadenende obturiert [11]. 1991 wird eine radikale Methode der kompletten zerebralen Ischämie beschrieben: Durch den dritten Interkostalraum wird ein Instrument zur kompletten Abklemmung des kardialen Gefäßstammes am aufsteigenden Aortenbogen direkt über der Aortenwurzel eingeführt. Die Letalität nach kardialer Reanimation von 48% ist allerdings inakzeptabel hoch [12]. Als den beschriebenen Modellen zur Erzeugung einer globalen zerebralen Ischämie überlegen stellt sich unserer Auffassung nach das von Ludolph dar, welches im Methodenteil ausführlich besprochen wird [13]. Der Verschluss beider Aa. vertebrales erfolgt hierbei von ventral unter Sicht und wird als sichere Variante erachtet. 1.2 Schädigungsmuster globaler ischämischer zerebraler Läsionen Einer ganzen Reihe von Untersuchungen liegt eine wie auch immer evozierte globale zerebrale Ischämie zu Grunde. Dabei können besonders die Pyramidenzellen des CA-1-Bandes des Hippokampus studiert werden, die bei der Läsion den größten Schaden davontragen. Lichtmikroskopisch imponiert der Verlust von Pyramidenzellen, der durch schlichtes Auszählen quantitativ recht genau erfasst werden kann [14,15]. Über das Wesen dieser Schädigung beim mongolischen Gerbil hat Kirino in den 1980er Jahren ausführlich gearbeitet. Dort unterscheidet er zwischen drei unterschiedlichen Formen der Schädigung in der CA1-, der CA2- und der CA4-Region: Die Schädigung 10 in der CA4-Region erfolgt rasch, d. h. innerhalb weniger Stunden, und entspricht der ischämischen Zellveränderung auf Grund des Versagens der Ionenpumpe in der Plasmamembran, also Ballonierung und Schwellung, auch Onkose genannt [16]. Langsamer geht die Schädigung im CA2-Band vonstatten: Hier spricht Kirino von sog. „reaktiven ischämischen Veränderungen“ [17]. Am längsten jedoch dauern die Veränderungen in der CA1-Region: Lichtmikroskopisch werden sie frühestens am zweiten Tage nach der Ischämie auffällig, und die elektronenmikroskopische Analyse ergibt eine „lamelläre Reihung proliferierter Zisternen des endoplasmatischen Retikulums“. Diese Form des Zelltodes wird damals „verzögerter neuronaler Zelltod“ genannt [17]. Die Natur dieses „delayed neuronal death (DND)“ wird auch zwei Jahre später noch verkannt und kann nur deskriptiv erfasst werden [18]. Wiederum zwei Jahre später gelingt der Nachweis der parziellen Reversibilität durch Applikation von Pentobarbital [19]. Heute gilt als weitgehend gesichert, dass es sich bei dieser Form des „verzögerten neuronalen Zelltodes“ um Apoptose handelt [20, 21], und gelelektrophoretisch sind DNA-Fragmentationen feststellbar [22-24], wenngleich in einer Arbeit der elektronenmikroskopische Nachweis gegen die Apoptose als Mechanismus des neuronalen Zelltodes geführt wird [25]. Weitere Arbeiten zeigen, dass ischämieinduzierte Nekrosen von Apoptosen begleitet sind [16, 26]. Tatsächlich zeigt die Empirie, dass die CA1-Region diejenige ist, die am sensibelsten, sprich nach kürzester Ischämiezeit, auf ischämischen Stress durch Zelltod reagiert: In Abhängigkeit von der Zeit der Ischämie werden in aufsteigender Reihenfolge der Widerstandsfähigkeit zunächst die Pyramidenzellen der CA1- und CA4- Region des Hippokampus, dann die Neurone des Subikulums, 11 neokortikale Zellen und schließlich Neurone der CA3-Region und des Kaudoputamens affiziert, nach sehr langen Ischämiezeiten schließlich wird auch der zerebrale Kortex, dort vor allem die superolaterale Konvexität, betroffen [27]. Unternimmt man den Versuch, den Schaden genau zu analysieren, welcher den Neuronen unter hypoxisch-ischämischem Stress widerfährt, so kann man direkt nach der Ischämie die vollständig reversible Ausprägung von Mikrovakuolen beobachten. Im späteren Verlauf tritt eine irreversible ödematöse Zellveränderung auf, die gar zum Bersten der Zellmembran führen kann [28]. Einen maßgeblichen Beitrag zur Beantwortung der Frage des lichtmikroskopisch sichtbaren Schadens leistet Mennel mit seiner Arbeit „Morphologie des Gewebeschadens infolge experimenteller zerebraler Ischämie bei der Ratte“: Verschließt man bei der Ratte beide Karotiden permanent über einen Zeitraum von einer, zwei oder drei Wochen, so treten Territorialinfarkte auf über die Stufen von nekrotischen, blassen Gewebearealen bis hin zu ischämischen Zysten. Am Randgebiet kann eine astrogliale Reaktion beobachtet werden. Beim zehnminütigen Karotisverschluss mit systemischer Hypotonie ist am zweiten postischämischen Tage kaum eine Veränderung feststellbar, der „verzögerte neuronale Tod“, also die Apoptose, wie man heute weiß, tritt dann am sechsten Tage auf [29]. 1.3 Biochemische Vorgänge periischämisch Um die Kausalzusammenhänge ischämischer Läsionen zu verstehen, sind Untersuchungen auf biochemischer Ebene vorgenommen worden. Mithilfe des sogenannten Mikrodialyseverfahrens können prä-, intra- und postischämisch die Konzentrationen von Aminosäuren, eben den Neurotransmittern, gemessen werden. 12 Bereits 1984 kann gezeigt werden, dass eine transiente zerebrale Ischämie durchaus einen Effekt auf die extrazelluläre Transmitterkonzentration hat: So ist der Anteil an Glutamat um das Achtfache, der an Aspartat um das Dreifache während der Ischämie erhöht. Aus dieser Beobachtung heraus entsteht die Annahme, dass der erhöhte Glutamat- und Aspartatspiegel an der durch die Ischämie induzierten neuronalen Schädigung beteiligt sein könnten [30]. In die Literatur findet dieses Phänomen Eingang unter dem Begriff der Exzitotoxizität [31-34]. Eine weitere bedeutende Rolle bei der ischämischen Schädigung scheinen Kalziumionen, Ca2+, zu spielen: 1988 führt eine Forschergruppe um Benveniste am neuropathologischen Institut der Universität zu Kopenhagen eine „Schafferotomie“ durch: Die SCHAFFER- Kollateralen, die eine Verbindung zwischen der CA1- und CA3-Region des Hippokampus darstellen, werden dabei zerstört. Diese Deafferentiation hat zur Folge, dass die ischämische Nervenzellzerstörung in CA1 vollständig ausbleibt, während in der Kontrollgruppe die Schädigung innerhalb von 2-3 Tagen manifest wird. Um die Rolle des intrazellulären Ca2+ einschätzen zu können, wird dann das interstitielle Ca2+ betrachtet – dieses nimmt in der Kontrollgruppe etwa 100 Sekunden nach Beginn der Ischämie um 90% ab, während in der Schafferotomie-Gruppe keine Veränderung des interstitiellen Ca2+ zu verzeichnen ist. Damit liegt es sehr nahe, dass der intraischämische Ca2+-Influx für die neuronale ischämische Schädigung bedeutsam ist [28, 35, 36]. Mehr noch, die Erhöhung des intrazellulären Ca2+ scheint direkt mit der Erhöhung des Neurotransmitters Glutamat zusammenzuhängen, dessen Konzentration während der Ischämie unter normalen Bedingungen um das Sechsfache zunimmt, während die mit einer Schafferotomie vorbehandelten Tiere nur eine 1,6-fache Zunahme aufweisen [37]. 13 Was aber geschieht nun mit den geschädigten Neuronen? Diese Frage lässt sich auf Zellorganellebene beantworten, wo das lysosomale Abbausystem (Degradation) zum Tragen kommt. Die mit unterschiedlichen Hydrolasen (z. B. Saure Phosphatase, Glukuronidase, Sulfatase, Ribonuklease, Kollagenase) gefüllten primären Lysosomen können rupturieren, so dass die freiwerdenden hydrolytischen Enzyme die Zelle an ihrem Lebensende auflösen („end- stage cellular dissolution“) oder aber über den Weg der Phagozytose den zellulären Debris abräumen [38]. Apoptotische Zellen und deren Fragmente haben an ihrer Oberfläche Markermoleküle, die umliegende Zellen und Phagozyten zum Einsatz kommen lassen. So werden die Residuen zuverlässig und restlos entfernt, und es kommt erst gar nicht zu einer inflammatorischen Reaktion [39]. Ergebnisse einer Arbeit aus dem Jahre 1994 legen nahe, dass in exzitotoxisch geschädigten Neuronen die Expression des Genproduktes des Tumor-Suppressor-Genes p53 erhöht ist: Gemessen wurde der Spiegel der p53-mRNA nach Schädigung durch das Glutamat-Analogon Kainat. Dieser Befund galt auch für Neurone, deren DNA fragmentiert war. Damit ist davon auszugehen, dass in ischämischen Arealen die apoptotische Kaskade eingeleitet wird [40]. Zuletzt soll die elektrophysiologische Ebene betrachtet werden, die einen weiteren Aufschluss über die biochemischen Vorgänge periischämisch gibt. Etwa drei Minuten nach dem Einsetzen einer fünfminütigen fokalen Frontalischämie ist eine rasche Depolarisation des Membranpotenzials der CA1-Pyramidenzellen bis auf -20mV zu verzeichnen. Die Amplitude dieser Depolarisation ist umso größer, je schwerer die Ischämie ist, und sie tritt umso früher auf, je höher die intrazerebrale Temperatur ist [41]. 14 1.4 Baclofen und der GABA-Rezeptor 1.4.1 Substanz Baclofen ist das beta-p-Chlorophenyl-Derivat von GABA und somit ein selektiver GABAB-Agonist, der die präsynaptische Glutamatfreisetzung in vivo inhibiert [42-45]. Die biologische Aktivität des sowohl als d- wie auch als l-Enantiomers vorkommenden Baclofens geht in der Hauptsache von der linksdrehenden Form aus [46], die 180fach potenter ist als die rechtsdrehende [47]. Wiederholte Baclofen-Applikation evoziert eine Toleranz, deren Ursache als noch nicht genau geklärt angesehen werden muss, recht gewiss jedoch steht nicht der Mechanismus der Rezeptor-Down-Regulation dahinter [48]. Bedeutsam für das Experiment ist die Auslösung einer Hypothermie, die eine maximale Ausprägung nach einer Stunde bei subkutaner Applikation erfährt [48]. 1.4.2 Pharmakokinetik Baclofen wird bei enteraler Applikation zu mehr als 80-90% im Magen- Darm-Trakt resorbiert und renal eliminiert. Da es die Blut-Hirn- Schranke nur unter größten Mühen penetriert, betragen die Hirngewebemengen von Baclofen nur etwa 10% des Serum-Spiegels [49]. 1984 wird daher eine intrathekale Applikation vorgeschlagen, die eine höhere Verfügbarkeit und Wirksamkeit verspricht [50]. 15 1.4.3 Der GABA-Rezeptor Glutamat ist der bedeutendste exzitatorische Transmitter im zentralen Nervensystem. Die γ–Aminobuttersäure hingegen (γ-aminobutyric acid, GABA) ist hier der wichtigste inhibierende Transmitter. Ebenso wie Glutamat zur Entfaltung seiner Wirkung des Glutamat-Rezeptors (GluR) bedarf, ist für GABA ein Rezeptor bzw., wie man heute weiß, eine Rezeptorfamilie vonnöten: Bei Unterscheidung von GABAA- und GABAB- Rezeptoren spielt Baclofen eine bedeutsame Rolle. Es ist ein neuer GABA-Rezeptor gefunden worden, der von bewährten GABA- Antagonisten wie Bicucullin oder GABA-Mimetika wie 3-Amino- Propansulphonat (3-APS, Homotaurin) oder (3SR, 4RS)-3,4- Epoxipiperidin-4-Carboxylat (Isoguvacinoxid) unberührt bleibt. Man definiert den Bicucullin-empfindlichen Rezeptor als GABAA-, den Baclofen-empfindlichen als GABAB-Rezeptor (GABAAR und GABABR). Es handelt sich um ein Heterodimer, das aus zwei Untereinheiten besteht mit 7 transmembranären Domänen, die am Karboxyl-Ende miteinander verbunden sind. Die offenliegenden Ligandenbindungsdomänen liegen an der extrazellulären Membranoberfläche bei R1 und R2. Durch Aktivierung des Heterodimers wird eine Adenylatzyklase G-Protein- gekoppelt aktiviert, durch welche die K+- und Ca2+-Leitfähigkeit beeinflusst wird [51, 52]. Die Verteilung des GABABR erstreckt sich neben dem ZNS auch auf periphere Organe und Gewebe [53]. Die höchste Dichte findet sich in der angegebenen Reihenfolge in den thalamischen Kerngebieten, dem Stratum moleculare des Zerebellum, dem zerebralen Kortex, dem Nucleus interpeduncularis und dem Hinterhorn des Rückenmarks [54- 56]. Mit den Dosierungen aus vorangegangenen Studien und den Begründungen für das Versagen der Wirksamkeit ergeben sich nun die unten aufgeführten Fragestellungen. 16 1.5 Fragestellungen 1) Ist 1µg Baclofen, gelöst in 5µl NaCl, das 30 Minuten vor einer zehnminütigen Globalischämie über einen Zeitraum von fünf Minuten in den rechten Seitenventrikel einer 250g schweren männlichen Wistar-Ratte appliziert wird, in der Lage, die Zahl der nach einer Woche Überlebenszeit geschädigten Neurone im CA1- bis CA3-Band des Hippokampus zu vermindern? 2) Sind 2µg Baclofen, gelöst in 5µl NaCl, die 30 Minuten nach einer zehnminütigen Globalischämie über einen Zeitraum von fünf Minuten in den rechten Seitenventrikel einer 250g schweren Wistar-Ratte appliziert werden, in der Lage, die Zahl der nach einer Woche Überlebenszeit geschädigten Neurone im CA1- bis CA3-Band des Hippokampus zu vermindern? In der vorliegenden Arbeit sollen diese Fragen anhand experimenteller Untersuchungen mit einer statistischen Auswertung beantwortet werden. 17 2 Material und Methoden In einem Ischämiemodell soll Baclofen intrathekal appliziert werden. Es wird eine zehnminütige reversible zerebrale Globalischämie durch einen Vier-Gefäß-Verschluss (4-vessel occlusion model, 4VOM) herbeigeführt. Unter kontinuierlicher Überwachung der Vitalparameter findet die Baclofenapplikation 30 Minuten vor bzw. 30 Minuten nach der Ischämie statt. 2.1 Materialien 2.1.1 Tiere und Tierhaltung  Männliche Wistar-Ratten, Gewicht: 250 – 350g, Harlan- Winkelmann, Borchen, Deutschland  Käfige der Größe 42cm x 26cm x 19cm  Futterpellets, Altromin®, Lage, Deutschland 2.1.2 Materialien für Globalischämie  Operationstisch für Kleintiere, Technical & Scientific Equipment GmbH, Bad Homburg vor der Höhe, Deutschland  Operationsmikroskop, Vergrößerung bis 16fach, OPMIMD, Carl Zeiss, Jena, Deutschland  Lichtquelle Xenon/Halogen, Superlux 300®, Carl Zeiss, Jena, Deutschland  Stativ, Contraves AG, Zürich, Schweiz  Halothan-Vaporisateur, Vapor 19.3, Drägerwerk AG Lübeck, Deutschland  Messröhrenblock für O2 (bis 15l/min) und N2O (bis 12l/min), Messer-Griesheim GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland 18  Druckminderer für 50l-Flaschen O2 und N2O, Präzicon®, Greggersen, Deutschland  N2O (Stickoxidul pro narcosi), 50l, Messer-Griesheim GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland  O2 (Medizinischer Sauerstoff), 50l, Messer-Griesheim GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland  Heizunterlage, Homeothermic Blanket System, 150 x 250mm2, heizbar, mit elektronischem DC-Steuergerät und Rektalsonde für Ratten, Technical & Scientific Equipment GmbH, Bad Homburg vor der Höhe, Deutschland  Präparierschere, METZENBAUM, Technologietransfer Marburg, TTM, Deutschland  Chirurgische Pinzette, ADSON, Technologietransfer Marburg, TTM, Deutschland  Mikroschere Sensation, bajonettförmig, stumpf/stumpf, FM 140 R, Aesculap, Tuttlingen, Deutschland  2 Mikropinzetten, Spitzenbreite 0,15mm, FM 001 R, Aesculap, Tuttlingen  Wundspreizer, WEITLANER, stumpf, BV 074, Aesculap, Tuttlingen  Raspatorium nach DAVIS, FF 300, Aesculap, Tuttlingen  Nadelhalter, DE BAKEY, BM 032 R, Aesculap, Tuttlingen  Feine Arterienklemme, HALSTED-MOSQUITO, gebogen, BH 111 R, Aesculap, Tuttlingen  2 Gefäßklemmen, DE BAKEY, gerade, FB 352 R, Aesculap, Tuttlingen  Aneurysma-Klip, YAŞARGIL, bajonettförmig, FT 727 T, Aesculap, Tuttlingen  2 Aneurysma-Klips, YAŞARGIL, FT 722 T, Aesculap, Tuttlingen 19  Anlegezange für Klips, bajonettförmig, FT 402 T, Aesculap, Tuttlingen  Mikronadelhalter, REILL, gebogen, FD 243 R, Aesculap, Tuttlingen  Mikro-Knüpfpinzette, gebogen, FD 281 R, Aesculap, Tuttlingen  Nerv- und Gefäßhäkchen, KRAYENBÜHL, FD 396 R, Aesculap, Tuttlingen  Koagulationsgerät, Bipolarkoagulator tb 50, Aesculap, Tuttlingen  Bipolarpinzette, bajonettförmig, GK 764 R, Aesculap, Tuttlingen  Dreiwegehahn, Discofix®, B. Braun, Melsungen, Deutschland  Katheter mit Flügeln, Introcan-W®, 24G (0,7mm x 19mm), B. Braun, Melsungen  Einmalspritze, 5ml, B. Braun, Melsungen  Einmalspritze, 1ml, Monoject, Sherwood Medical, Northern Ireland  NaCl, 500ml, B. Braun, Melsungen  Heparin, Liquemin® N 25.000, 400I.E./ml, Hoffmann-La Roche AG, Grenzach – Wyhlen, Deutschland  Lidocainhydrochlorid 2%, Xylocain®, Astra, Wedel, Deutschland  Dexpanthenol, Bepanthen®Roche, 5g, Augen- und Nasensalbe, Hoffmann–La Roche AG, Grenzach-Wyhlen  Geflochtenes chirurgisches Nahtmaterial, resorbierbar, 4/0, Vicryl®, Ethicon, Norderstedt, Deutschland  Geflochtenes chirurgisches Nahtmaterial, resorbierbar, 6/0, Vicryl®, Ethicon, Norderstedt, Deutschland  Monofiles, chirurgisches Nahtmaterial, nicht resorbierbar, 10/0, Ethilon®, Ethicon, Norderstedt  Medizinisches Pflaster, 3M Health Care, Durapore, St. Paul, U.S.A. 20  Kompressen, 7,5 x 7,5cm2, Paul Hartmann AG, Heidenheim, Deutschland  Wattekügelchen, 1,5g, Größe 000, Roeko, Langenau, Deutschland  Puderfreier Untersuchungshandschuh in OP-Handschuhqualität, Biogel®-Diagnostic, Regent Medical, Boxbourne, UK  Watteträger  TempControl I mit Nadelsonde und 100W-Infrarotlampe, Technical & Scientific Equipment GmbH, Bad Homburg vor der Höhe 2.1.3 Materialien für die stereotaktische Zielpunktbestimmung und für die Injektion  Einmalskalpell, Gr. 15, Feather, Japan  H2O2 3%, Apotheke der Philipps-Universität, Marburg, Deutschland  Baclofen, Lioresal® intrathecal, 10mg/5ml, Novartis DuPont, Bad Homburg  Polyethylenschlauch (ID 0,58mm / AD 0,96mm), Portex Polythene Tubing, SIMS Portex, Großbritannien  Pipettenspitzenauszieher, „Needle Pipette Puller“, Model 750, David Kopf Instruments, Tujunga, Kalifornien  Glaskapillaren (ID 0,6mm / AD 1,0mm)  Kanülenschaft ohne Luer Lock, 24 GA1, 0,55mm x 25mm, Bexton Dickinson, Drogheda, Irland  Präzisionsspritze, 1,0ml, Exmire Microsyringe, Ito Corporation, Fuji, Japan 21  Spritzenpumpe, Univentor High Precision Instruments 802 Syringe Pump, Bulebel Industrial Estate, Zejtun, Malaga, Spanien  Stereotaxiegestell, David Kopf Instruments, Tujunga, Kalifornien  Elektrobohrer Minimot 40 (20.000U/min), 40W, Durchmesser des Bohraufsatzes: 0,7mm, Proxxon, Deutschland  Fremdkörperhebel, PLANGE, Storz Instruments, Bausch & Lomb, Heidelberg, Deutschland  Knochenwachs, Lukens, Großbritannien 2.1.4 Materialien zur Messung von Vital- und Laborparametern  Blutdruckmessmodul mit Registrierteil, Hellige GmbH, Freiburg im Breisgau, Deutschland  Glucometer Elite® mit Teststreifen, Bayer Diagnostics, Leverkusen, Deutschland 2.1.5 Materialien zur In-vivo-Fixierung des Rattenhirns  Rollerpumpe, Watson-Marlow Bredel Pumps, Model 323, Falmouth Cornwall, Großbritannien  NaCl, 500ml, B. Braun, Melsungen  Paraformaldehyd in PBS-Puffer (phosphate buffered saline), 500ml  Kleintierguillotine, Eigenbau  Irisschere, Technologietransfer Marburg, TTM  Feine Arterienklemme, HALSTED-MOSQUITO, BH 120 R, Aesculap, Tuttlingen, Deutschland  Chirurgische Pinzette, ED 561, Aesculap, Tuttlingen  Chirurgische Pinzette, ED 557, Aesculap, Tuttlingen 22  Schere, gebogen, BC 423 R, Aesculap, Tuttlingen  Spatel zur Mobilisation des Hirns, Laborbedarf Kobe, Marburg  Bulldog-Klemme Technologietransfer Marburg, TTM  Bassin, 30 x 18 x 6 cm3  Reagenzglasständer, Laborbedarf Kobe, Marburg 2.1.6 Materialien zur histologischen Aufarbeitung der Gehirne  Wärmeschrank, Forma Scientific, Model 3156, water-jacketed incubator, Marietta, Ohio, U.S.A.  Paraffin, schüttfähig, für die Histologie, Erstarrungspunkt ca. 56° - 58°C, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland  Paraffin, en bloc, Schmelzpunkt ca. 54°C, Merck KGaA, Darmstadt  Schneidevorrichtung für Gehirne, Eigenbau, freundliche Leihgabe der Abteilung für Neuropathologie der Philipps-Universität, Marburg  Ethanol, 80%, Apotheke der Philipps-Universität, Marburg  Ethanol, 96%, Apotheke der Philipps-Universität, Marburg  Isopropanol, Riedel-de Haën®, Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Deutschland  Xylol, Riedel-de Haën®, Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze  Schlittenmikrotom, Typ 1208, Leitz, Wetzlar, Deutschland Färbungen:  AmFe (Ammoniumeisensulfat), Riedel-de Haën®  Aqua dest, Riedel-de Haën®  HCl (37%), Riedel-de Haën® 23  Cölestinblau, Riedel-de Haën®  Säurefuchsin, Riedel-de Haën®  Eisessig, Riedel-de Haën® 2.1.7 Materialien zur Quantifizierung der hippokampalen Läsion  Lichtmikroskop, Carl Zeiss, Jena, Vergrößerung 200-fach  Fadenokular mit Zählkammern, 20mm, Carl Zeiss, Jena  Handzählgerät, Laborbedarf Kobe, Marburg 2.2 Methoden 2.2.1 Operationsvorbereitung Bei dieser tierexperimentellen Studie werden männliche Wistar-Ratten der Firma Harlan-Winkelmann verwendet (siehe Abb. 1). Abb. 1: Vier männliche Wistar-Ratten, passager in einem geöffneten Käfig, mit Rohrstück zur Ablenkung und zum Zeitvertreib Eine unabhängige tierethische Kommission hat, fußend auf einem Tierversuchsantrag, die Notwendigkeit der Verwendung dieser Tiere geprüft. Alle beschriebenen Prozeduren werden in strikter Übereinstimmung mit den universitätsinternen Tierschutzrichtlinien durchgeführt. Die Haltung erfolgt unter konstanten klimatisierten Bedingungen bei einer Raumtemperatur von 23 ± 1°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 ± 5%. Der Hell-Dunkel-Rhythmus beträgt 12 24 Stunden, in den Käfigen befinden sich maximal vier Tiere. Am Tage vor dem Eingriff wird ein 250g bis höchstens 350g schweres Versuchstier bei freiem Zugang zu Trinkwasser von Futter ferngehalten (siehe Abb. 2). Abb. 2: Ratte auf der digitalen Waage Vom Käfig wird das Tier behutsam in ein 10cm x 15cm x 20cm großes Behältnis verbracht, wo es mit einem Gemisch von Stickoxidul/Sauerstoff (2:1) und 4% Halothan pränarkotisiert wird. Die Anästhesie wird durch das Ausbleiben einer Reaktion auf einen Schmerzreiz im Interdigitalraum getestet (siehe Abb. 3). Abb. 3: Teil des Equipments mit Pränarkotisierungsgefäß vorne rechts im Bild Sodann wird das Versuchstier auf dem Operationstisch an den Extremitäten fixiert (siehe Abb. 4 und Abb. 5). Abb. 4: Versuchstier auf dem OP-Tisch mit Heizdecke, daneben Mikroinstrumente Abb. 5: Mikrochirurgischer Arbeitsplatz 25 Die Narkose wird aufrechterhalten durch ein Inhalationsnarkosegasgemisch von Stickoxidul/Sauerstoff (2:1) und Halothan (1,5%) (siehe Abb. 6). Abb. 6: Stickoxidul und Sauerstoff in Flaschen mit Messröhrenblock, links Daneben ein Halothanvaporisateur („Vapor“) Durch eine Heizdecke, auf welcher das Tier liegt, kann die Körperkerntemperatur permanent auf 37 ± 0,5°C gehalten werden. Vermittels Rückkopplung über eine Rektalsonde wird in Abhängigkeit von der Temperatur Wärme über eine 50W Heizdecke appliziert, die sich zum Schutz des Tieres auf maximal auf eine Temperatur von 45°C aufheizt (siehe Abb. 7). Abb. 7: Versuchstier auf der Heizdecke mit Rektalsonde zur Temperatur- messung Die Kornea des Tieres wird mit reichlich Dexpanthenol-Salbe bedeckt und so vor Austrocknung und thermischer Läsion durch Wärmeeinstrahlung geschützt. 2.2.2 Durchführung der Globalischämie 2.2.2.1 Legen eines arteriellen Zuganges Ein etwa 4cm langer inguinaler Parallelschnitt zum linken lateralen Rand des Musculus obliquus externus abdominis laterokaudal vom 26 Ligamentum inguinale eröffnet den Blick auf das Leistenband und die femoralen Leitungsbahnen. Dazu wird mit der Präparierschere nach METZENBAUM inzidiert und zunächst stumpf weit vorpräpariert und unterminiert, ehe der Schnitt gesetzt wird. Eventuelle Blutungen werden mit der Bipolarpinzette gestillt (siehe Abb. 8). Abb. 8: Aufspreizen des Inguinal-Situs zur Darstellung der femoralen Leitungsbahnen Mit dem Operationsmikroskop werden bei maximaler Vergrößerung die Femoralgefäße fokussiert (siehe Abb. 9). Mit den Mikropinzetten wird die A. femoralis (siehe Abb. 10) mobilisiert und möglichst weit distal mit einem Faden der Stärke 4/0 ligiert (siehe Abb. 11). Lokal appliziertes Lidocain blockiert die äußerst empfindlichen postganglionären sympathischen Fasern, hebt damit den Vasokonstriktorentonus an diesem Gefäßabschnitt auf und ermöglicht so leichter die Kanülierung mit dem Flügelkatheter (siehe Abb. 12). Sodann wird das Lidocain mit einer Kompresse wieder weitestgehend entfernt, um bei der Punktion kein Einbringen des Lokalanästhetikums in den Kreislauf zu gestatten und eine systemische Wirkung zu verhindern (siehe Abb. 13). Nach der Fixierung mit einem Faden der Stärke 4/0 sind Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks, Probenentnahme und Spülung möglich. Abb. 9: Von medial (unten im Bild) nach lateral (oben): V., A. und N. femoralis. Lateral die Bauchwand (M. obliquus externus abdominis) 27 Abb. 10: A. femoralis, dilatiert mit Lidocain Abb. 11: A. femoralis, ligiert mit einem Faden der Stärke 4/0 Abb. 12: Kanülierung mit 27G- Flügelkatheter Abb. 13: Lidocain wurde weggetupft und der Flügelkatheter mit Haltefäden versehen Nach Beendigung des Eingriffes wird die A. femoralis mit einem Klip temporär verschlossen und die Kanüle aus der Arterie entfernt. Die entstandene Leckage wird mit drei Stichen mit einem Faden der Stärke 10/0 evertierend genäht, um möglichst wenig thrombogene Kontaktfläche an der Intima entstehen zu lassen. Übersteht die Naht die retrograde Perfusion nach Entfernen der distalen Ligatur, kann auch der proximale Klip entfernt werden. 28 Die Hautwunde wird mit einem Faden der Stärke 4/0 versorgt (siehe Abb. 14). Abb. 14: Verschluss des Inguinalsitus am Ende der OP 2.2.2.2 Präparation der hirnversorgenden Arterien Unter Zuhilfenahme des Operationsmikroskops bei mittlerer Vergrößerung wird mit der Präparierschere die Haut vom Os hyoideum bis zur Incisura jugularis eingeschnitten (siehe Abb. 15-17). Abb. 15: Ventraler Zugangsbereich. Eine Rasur des Fells ist nicht erforderlich Abb. 16: Inzision der Haut über Gl. thyreoidea und Platysma Abb. 17: Exposition der Gl. thyreoidea 29 Abb. 18: Längsinzision der Schilddrüse, Exposition der infrahyalen Muskulatur Abb. 19: Die Mm. sternohyoidei werden aus dem Situs präpariert und mit Haltefäden auf Distanz gebracht Das darunterliegende Platysma wird, wo nötig, median mit der Mikropräparierschere gespalten. Ebenso werden die Lobi der gut vaskularisierten Glandula thyroidea in der Mittellinie, am Isthmus, gespalten, bis die infrahyale Muskulatur zum Vorschein kommt (Abb. 18). Die intermuskulären Adhäsionen der beiden Mm. sternomastoidei, wie sie bei der Ratte heißen, werden gelöst, dieselben mit dem Raspatorium lateral unterminiert und beidseits von den Mm. sternohyoidei getrennt. Nun kommt bereits die Arteria carotis communis (CCA) zum Vorschein, die an der entscheidenden Stelle vom Venter superior musculi omohyoidei bedeckt wird, was die Darstellung etwas erschwert (siehe Abb. 19). Abb. 20: In der Tiefe kommt lateral neben dem N. vagus die A. carotis communis zur Darstellung Die folgenden Schritte werden bei maximaler Vergrößerung durchgeführt. 30 Die CCA (Abb. 20) wird beidseits aus der Gefäß-Nervenscheide mobilisiert und mit einem Vessel-Loop zur leichteren Auffindbarkeit versehen (siehe Abb. 21 und 22). Abb. 21: Die CCA wird mobilisiert und hervorluxiert Abb. 22: Im nächsten Schritt wird die CCA mit einem Vessel-Loop markiert Nun wird der Operationstisch kranial um 30° eleviert, die Optik des Mikroskops um 45° in der Longitudinalebene gekippt und medial der CCA mit den Mikropinzetten das Tuberculum anterius vertebrae cervicalis sextae als Landmark aufgesucht, klinisch kurz Processus caroticus genannt (siehe Abb. 23 und 24). Das bei diesem Präparationsschritt immer wieder austretende Exsudat und auch das geringfügige Blut werden mit einem Q-Tip oder weiter in der Tiefe mit Wattekügelchen aufgenommen (siehe Abb. 25). Die Arteria vertebralis, der ein Nerv vom sympathischen Grenzstrang ventral anliegt, wird dargestellt, wo sie kaudal des Processus caroticus in die Vertebra cervicalis VI eintritt (siehe Abb. 26). Abb. 23: In der Tiefe schimmert der Processus caroticus hindurch 31 Abb. 24: Hier liegt nur noch eine dünne Muskelschicht darüber Abb. 25: Austretendes Exsudat wird aufgenommen und stumpf voranpräpariert Abb. 26: Der siebte zervikale Spinalnerv kommt zur Darstellung Im Weiteren werden die anatomischen Strukturen verdeutlicht. Abb. 27: Die Arteria vertebralis wird angeschlungen Abb. 28: Zusätzlich angeschlungen sind die CCA und zwei Spinalnerven In einem derartig präparierten Situs ist eine Ligatur der bedeutendsten hirnversorgenden Arterien möglich. 32 2.2.2.3 Induktion der reversiblen zerebralen Globalischämie Kurz vor der Eintrittsstelle der A. vertebralis in den sechsten Halswirbel wird mit der Anlegezange auf beiden Seiten ein Aneurysmaklip nach YAŞARGIL appliziert. Dabei wird zunächst die linke, in der regelrechten Anatomie oft kleinere A. verebralis okkludiert, danach die etwas größere rechte (siehe Abb. 29 und 30). Abb. 29: Die A. vertebralis wird mit einem Titanklip passager komprimiert Abb. 30: YAŞARGIL-Klip im Situs Die beiden CCA werden mit Gefäßklemmen nach DE BAKEY verschlossen (siehe Abb. 31). Abb. 31: Alle vier hirnversorgenden Arterien sind passager verschlossen Abb. 32: Während der globalen Ischämie wird die Temperatur intrakraniell mit einer Infrarotlampe konstant gehalten, die einem Rückkoppelungsmechanismus unterliegt 33 Dieses verbesserte Verfahren des 4VOM hat Alexander Ludolph (2002) etabliert. Während der zehnminütigen Ischämie wird die Temperatur unter der Kopfhaut von einer Sonde gemessen und mit einer seitlich angebrachten Rotlichtlampe über einen Rückkopplungsmechanismus konstant bei 37°C gehalten (siehe Abb. 32). Zum Schutz der Kornea wird auch hier Dexpanthenol-Salbe verwendet. 2.2.3 Stereotaktische intrazerebroventrikuläre Applikation von Baclofen 2.2.3.1 Stereotaktische Zielpunktbestimmung bei der Ratte Die Methoden der Stereotaxie vermitteln die Möglichkeit, z. B. die Spitze einer in einen Halteapparat eingespannten Kanüle an jeden beliebigen Punkt in einem vorgegebenen dreidimensionalen Raum zu manövrieren. Der Hirnatlas von Paxinos und Watson macht es möglich, einem jeden Punkt im Gehirn der Ratte drei Koordinaten zuzuordnen und ihn somit exakt räumlich zu definieren [59]. In diesem Atlas sind die anatomischen Daten von 120 Ratten gemittelt und beziehen sich entweder auf Abstände von der Interaurallinie oder vom Bregma. Zur Zielpunktbestimmung wird die Ratte (250-350g) in einem Stereotaxierahmen so eingespannt, dass zwei Metallsporne, sog. Ohrpins, die in den Meatus acusticus externus eingeführt werden, das Kranium derart fixieren, dass der Schädel theoretisch frei um die Interaurallinie rotiert werden kann. Eine Schneidezahn-Stange, die palatinal am Gingivarand der beiden superioren Dentes incisivi 34 transversal angelegt wird, fixiert den Kopf der Ratte bis auf Bruchteile eines Millimeters. Wenn die Ebene durch Bregma und Lambdanaht waagerecht ist, gibt es eine 10mm darunter gelegene Parallelebene, die sich definiert durch die Interauralllinie und einen Punkt, der genau 3,3mm senkrecht über der Schneidezahn-Stange liegt. Aus dem Atlas lässt sich die Entfernung des anzuvisierenden Punktes von der Interaurallinie bis auf 0,5mm rostral (Interaurallinie + x) bzw. dorsal (Interaurallinie - x) angeben. Dieser Koronarschnitt zeigt nun eine zweidimensionale Ebene. Der Punkt wird weiter definiert einerseits durch den lateralen Abstand von der Mittellinie und andererseits durch den superioren Abstand von der in der Interaurallinie liegenden Ebene. In der Praxis liegt ein Schlitten vor, der in alle drei Raumrichtungen auf einem Dummy, einem zweiten Stereotaxierahmen, beweglich ist. An diesem Mikromanipulator ist eine Kanüle fixiert - der Zeiger - welcher auf die Koordinaten (0/0/0) eingestellt ist. Dieser Punkt befindet sich exakt zwischen den beiden Metallspornen. Auf den Skalen des Dummies liest man nun die Koordinaten (a/b/c). Dabei ist „a“ die anteriore (+) bzw. posteriore (-) Entfernung von der Interaurallinie, „b“ die superiore Entfernung von derselben und „c“ der rechtslaterale Abstand von der Mittellinie. Der Punkt, der zur Baclofenapplikation aufgesucht werden soll, liegt in der Mitte des rechten Seitenventrikels und befindet sich 7,7mm vor der Interaurallinie, 6,5mm über ihr und 2,0mm lateral von der Mittellinie. Damit hat er die Koordinaten (a+7,7/b+6,5/c+2,0). Genau diese Koordinaten werden auf das Stereotaxiegestell übertragen, in welches das Versuchstier eingespannt wird. 35 2.2.3.2 Beschreibung der Applikationsvorrichtung Die Glaskapillaren werden in den Pipettenspitzenauszieher eingespannt und nach dem Ausziehen auf eine Länge von etwa 5cm gebracht. Mit einer Feile wird der Luer-Lock von der Kanüle abgetrennt. Der entstandene Kanülenschaft verbindet den etwa 50cm langen Polyethylenschlauch mit der Glaskapillare. Die Adaptation von Glaskapillare und Polyethylenschlauch an der Kanüle erfolgt mit Sekundenkleber. Nun wird die Glaskapillare in den Schlitten des Stereotakten eingespannt. Im Anschluss daran wird der Polyethylenschlauch mit einer Präzisionsspritze verbunden, die ihrerseits in die Spritzenpumpe eingespannt wird. Baclofen als Injektionslösung wird auf eine Konzentration von 1µg/5µl für die präischämische und 2µg/5µl für die postischämische Applikation verdünnt, die Präzisionsspritze damit aufgefüllt. Pro Minute wird 1µl mit der Spritzenpumpe über die Injektionskanüle in den Seitenventrikel appliziert. Bei den je 12 Tieren der Kontrollgruppe erfolgt die Applikation von 5µl physiologischer Kochsalzlösung prä- bzw. postischämisch. 2.2.3.3 Applikation von Baclofen Das Versuchstier wird mitsamt Katheter, Rektalsonde, Heizunterlage und Beatmungsmaske in Bauchlage auf eine Unterlage verbracht, die es erlaubt, den Körper des Tieres in möglichst physiologischer Stellung zu halten, wenn der Schädel des Tieres im Stereotaxierahmen fixiert wird. Dazu werden die beiden von lateral kommenden Ohrpins in den Meatus acusticus externus eingeführt, die das Trommelfell penetrieren 36 und an der medialen Wand der Paukenhöhle zu liegen kommen. Der Abstand beider Spitzen beträgt bei Tieren, die weniger als 300g wiegen, etwa 11,0mm, bei solchen, die schwerer sind, etwa 12,0mm. Zur endgültigen Fixierung wird die Schneidezahn-Stange entsprechend angelegt. Mit einem Skalpell wird nun die Kopfhaut bis auf den Knochen medial auf einer Länge von 3cm gespalten. Mit einem Raspatorium wird die Galea aponeurotica vom Periost gelöst und lateralisiert. Die blutenden Venae emmissariae und eventuell angeschnittene Arteriolen werden elektrokoaguliert, das Periost mit Wasserstoffperoxid gesäubert. Nun ist der Bereich um das Bregma gut sichtbar. Der Schlitten mit der darauf befindlichen Kanüle zur Injektion wird auf seine anteriore Position gerückt und die Kanüle von superior dem Periost genähert. Die Position des Bohrloches auf dem rechten Os parietale wird markiert, die Kanüle wieder entfernt und mit dem Bohrer die Kalotte trepaniert. Die Dura mater wird mit einem „Durahäkchen“, nämlich einer umgebogenen 24G-Nadel, perforiert. Nun kann die Kanüle auf ihre endgültige Position im Seitenventrikel gebracht und die Applikation gestartet werden. Im Anschluss wird die Kanüle entfernt, die Kalotte mit Knochenwachs abgedichtet und die Wunde desinfiziert. Mit einem Faden der Stärke 6/0 wird die Galea wieder zusammengenäht, mit einem solchen der Stärke 4/0 die Kopfhaut adaptiert. 2.2.4 Messung der Vital- und Laborparameter und Überwachung Über den Katheter in der A. femoralis ist die direkte Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks (MABP = „mean arterial blood pressure“) möglich. Ein Druckschlauch wird lediglich mit dem 37 Blutdruckmessmodul verbunden und der MABP fortlaufend vom Registrierteil auf Millimeterpapier gedruckt. Feste Zahlenwerte werden zu bestimmten, unten aufgeführten Zeitpunkten im Protokoll vermerkt. In den im Folgenden aufgeführten Abständen wird auch die Rektaltemperatur vermerkt, während der Ischämie wird zusätzlich die Schädeltemperatur notiert. Ebenso werden zu definierten Zeiten der Blutglukosegehalt bestimmt und eine Blutgasanalyse (BGA) durchgeführt. Das Probevolumen dafür beträgt nur etwa 10µl. Im präischämischen Versuch wird 1µg Baclofen 30 Minuten vor der Okklusion, im postischämischen Versuch werden 2µg Baclofen 30 Minuten nach der Okklusion appliziert. Die Schemata für den Präischämie- und Postischämieversuch sehen wie auf der folgenden Seite beschrieben aus, auf der sich anschließenden Seite findet sich der im Labor verwendete Datenbogen, der für jeden einzelnen Versuch ausgefüllt wurde. 38 Präischämische Applikation: Zeitpunkt MABP BGA Glukose Rektal- temp. Schädel- temp. FA X X X X VAO X X Prä Bac X X X Post Bac X X CCAO X X X X 5’ post CCAO X X X X 10’ post CCAO X X X 30’ post CCAO X X X X 60’ post CCAO X X Postischämische Applikation: MABP BGA Glukose Rektal- temp. Schädel- temp. FA X X X X VAO X X CCAO X X X X 5’ post CCAO X X X X Ende CCAO X X Prä Bac, 30’ post CCAO X X X X Post Bac, 35' post CCAO X X 60’ post CCAO X X X X 90’ post CCAO X X Abkürzungen: FA Nach Femoraliskatheter-Anlage; VAO Vertebral Artery Occlusion (Verschluss der Aa. vertebrales); CCAO Common Carotid Artery Occlusion (Verschluss der Aa. carotides communes); Bac Baclofengabe; MABP Mean Arterial Blood Pressure (mittlerer arterieller Blutdruck); BGA Blutgasanalyse. 39 Datum: Tier / Gewicht: Baclofendosis: 1 µg/5 µl O 2 µg/5 µl O Postischämische Applikation MABP [mmHg] Glukose [mg/dl] Rektal-/Schädeltemp. [°C] pH pCO2 pO2 A. femoralis Occlusion VA Occlusion CCA / 5' post occlusionem / 10' p. occ. / 30' p. occ. et prae Bac. 35' p. occ. et post Bac. 60' p. occ. 90' p. occ. Präischämische Applikation MABP [mmHg] Glukose [mg/dl] Rektal-/Schädeltemp. [°C] pH pCO2 pO2 A. femoralis Occlusion VA prae Bac. post Bac. Occlusion CCA / 5' post occlusionem / 10' p. occ. / 30' p. occ. 60' p. occ. 90' p. occ. Abb. 33: Datenbogen, so wie er im Labor verwendet worden ist 40 Das komplette Prozedere wird in einem Versuchsprotokoll festgehalten (siehe Abb. 33). Dort finden sich auch Anmerkungen zu Reaktionen des Tieres z. B. beim Aufwachen wieder sowie Komplikationen, etwa das frühzeitige Obturieren des arteriellen Zuganges. Nach der Operation und der Versorgung aller Hautwunden wird die Narkose ausgeleitet. Daher verbleibt es noch bei etwa 30°C unter einer Rotlichtlampe bis zum allmählichen Aufwachen im Käfig. 2.2.5 In-vivo-Fixierung der Ratte Nach einem siebentägigen postoperativen Überleben ist mit einer Aggravierung der neuronalen Läsion nicht mehr zu rechnen. Daher findet die Fixierung des Rattenhirns zu diesem Zeitpunkt statt. Das Tier wird mit Halothan in eine tiefe Narkose versetzt. Nun wird ein Oberbauchquerschnitt durchgeführt. Das Diaphragma wird inzidiert, der knöcherne Thorax entlang der Medioklavikularlinie aufgeschnitten und das Herz dargestellt. Mit einer Schere wird der linke Ventrikel inzidiert und eine stumpfe Kanüle bis in die Aorta ascendens gescho- ben. Mit einer Bulldog-Klemme wird die mit der Rollerpumpe konnek- tierte Kanüle im Gefäß fixiert, dann die rechte Auricula cordis inzidiert. Nun wird der komplette Körper der Ratte mit etwa 100ml physiologischer Kochsalzlösung perfundiert, hiernach erfolgt eine Perfusion mit 500ml einer 4%igen phosphatgepufferten Paraformaldehydlösung. Die ausgewaschenen Flüssigkeiten werden in einem Glasbassin, worin das Tier erhöht gelagert ist, aufgefangen. Die Ratte wird mit der Kleintierguillotine dekapitiert. 41 Das Hirn wird aus dem Neurokranium freipräpariert und hervorluxiert, anschließend für zwei Tage bei 4°C in Paraformaldehydlösung (s. u.) aufbewahrt, um danach bei derselben Temperatur in vergälltem Ethanol (70%) gelagert zu werden. Zur Herstellung der PBS-gepufferten Paraformaldehydlösung: KH2PO4 0,144g Na2HPO4 * 2 H2O 0,526g NaCl 8g Paraformaldehyd 40g Aqua dest. Ad 1000ml Die Lösung sollte möglichst frisch angesetzt werden. 2.2.6 Mikroskopie des Gehirns 2.2.6.1 Durchführung der histologischen Aufarbeitung des Gehirns Das Hirn wird mit der Schneidevorrichtung in einen 6mm messenden Block geschnitten. Die Schnittebenen liegen in der Incisura tentorii und 6mm rostral. Dieses Präparat wird in einer von der Konzentration her aufsteigenden Alkoholreihe (80%, 96% und Isopropanol) je zwei Stunden entwässert und im Anschluss daran in Xylol lipophilisiert. Einen Tag lang inkubiert das Präparat in niedrigschmelzendem Paraffin im Wärmebad bei 60°C, einen weiteren in hochschmelzendem ebenfalls in Wärmeschrank, wird dann in eine Einbettform verbracht und mit hochschmelzendem, 60°C heißen Paraffin ausgegossen. Die Aushärtung erfolgt bei Raumtemperatur. 42 2.2.6.2 Histologische Schnitte der Hippokampusregion Mit dem Mikrotom werden 10 Schnitte der CA1-Region des Hippokampus angefertigt, im Warmwasserbad geglättet und auf einem Objektträger im Wärmeschrank getrocknet. 2.2.6.3 Säurefuchsin-Cölestinblau-Färbung Das natürliche Präparat hat keinen oder nur einen geringen Bildkontrast. Man kann sich das empirisch unterschiedliche Färbeverhalten von Zell- und Gewebeanteilen zunutze machen, die bestimmte Farbstoffe mit unterschiedlicher Intensität festhalten. Diese absorbieren dann Licht im sichtbaren Spektrum (400-800nm), dessen Komplementärfarbe vom Auge wahrgenommen wird. Benutzte Färbungen haben also immer eine empirische Komponente: Wenn die entscheidenden Strukturen mit einem bestimmten Farbstoff gut herausgearbeitet worden sind, dieser sich also bewährt hat, wird er wieder verwendet. In unserem Falle ist dies die Färbung mit Säurefuchsin-Cölestinblau. Die chemische Formel von Säurefuchsin ist in der Abb. 34 beschrieben, die von Cölestinblau in der Abb. 35. 43 -SO3 NH2 CH3 C NH2 NaO3S NH2 + SO3Na Abb. 34: Säurefuchsin, Summenformel C20H17N3Na2O9S3 O NH2 HO OH N O N+ Cl- Abb. 35: Cölestinblau, Summenformel C17H18ClN3O4 Synonyme für diesen Farbstoff sind Fuchsin sauer, Fuchsin S, Rubin S, Säurefuchsin O, Acid Violet 19, Acid magenta, Acid rubin, Acid roseine, Fuchsintrisulfonate. Tingiert werden basische Kernbestandteile wie Protamine und Histone. Ergänzend wird mit dem Oxazinfarbstoff Cölestinblau gefärbt, der auch unter den Namen Celestine blue B, Mordant Blue 14 und Corein 2B bekannt ist [86, 87]. 44 Das Färbeprotokoll mit Rezept, wie es sich in unserem Labor etabliert hat, ist im Folgenden wiedergegeben. Absteigende Alkoholreihe: 5min Rotihistol oder Xylol (3 Durchläufe) 5min Isopropanol 5min EtOH 96% 5min EtOH 80% 5min EtOH 70% 5min Aqua dest (nach jedem Durchgang erneuern) Farbe: 10min Cölestinblau (vor jedem neuen Färben gut aufrühren) 5min fließendes Leitungswasser 1min Aqua dest 2min Säurefuchsin 2min Essigsäure Differenzierung: 1min fließendes Leitungswasser 1min Aqua dest 1min EtOH 70% 1min EtOH 96% 1min Isopropanol Aufsteigende Reihe: 5 min Rotihistol oder Xylol (3 Durchläufe) 45 Rezepte: Cölestinblau 1% (für 150ml): 1,5g AmFe (Ammoniumeisensulfat), wasserfrei, und 150ml Aqua dest werden verrührt, der Magnetrührfisch wird entnommen und 0,75ml HCl (37%) werden hinzugegeben und zum Kochen gebracht. Sobald das Gemisch kocht, wird die Wärmequelle ausgeschaltet, sodann 1,5g Cölestinblau zugegeben. Nach dem Abkühlen wird filtriert. Vor jedem Färbevorgang ist ein gründliches Umrühren erforderlich, die Haltbarkeit beträgt 2 Monate. Säurefuchsin 1% (für 200ml): 2,0g Säurefuchsin und 200ml Aqua dest werden verrührt. Ein Umrühren vor Gebrauch ist nicht erforderlich. Essigsäure 1% (für 200ml): 2,0ml Eisessig und 200ml Aqua dest werden verrührt. Die Lösung, die der Fixierung dient, muss vor Gebrauch nicht wieder gerührt werden. 46 2.2.7 Quantifizierung der Läsion Sorgfältig wird jener der Hirnschnitte ausgewählt, der die wenigsten Artefakte aufweist und daher am ehesten für die Zählung der geschädigten Zellen und für die Bestimmung ihres Anteils an den Gesamtzellen geeignet erscheint. Bei diesem Schnitt wird auf einer Seite das CA1- bis CA3-Band überschaut, wie in den Abb. 36 und 38 dargestellt. Sukzessive wird eine möglichst lange Linie von Zählkästchen des Fadenokulars in das CA1-Band gelegt. Ausgewertet werden ausschließlich die Zellen, die sich innerhalb des Mikroskopierfeldes befinden, welches von der Kastenreihe eingeschlossen wird. Abb. 36: Beispiel für eine mäßige Pyramidenzell-Schädigung im CA1- Band. Die Pfeilspitze zeigt pyknotische, leuchtend rot angefärbte Neurone Abb. 37: Deutlicher Zelluntergang im Bereich des Stratum pyramidale des Hippokampus mit Entzündungsreaktion des umgebenden Gewebes. Die Auf- nahmen wurden freundlicherweise von Alexander Ludolph zur Verfügung gestellt. 47 Mit einem Zählgerät pro Hand werden links die intakten, also offensichtlich nicht geschädigten Zellen gezählt, während mit der rechten Hand die geschädigten Zellen erfasst werden. Auf diese Weise ist gewährleistet, dass jede Zelle genau einmal erfasst wird und nicht etwa bei einem zweiten Zähldurchgang doppelt gezählt wird – einmal als geschädigte, dann als intakte – oder gar überhaupt nicht erfasst wird, weil man sie beim zweiten Durchgang bereits der anderen Gruppe zugehörig wähnt. Dieselbe Prozedur muss dann noch beim kontralateralen Hippokampus erfolgen. Das Ergebnis einer Zählung ist der prozentuale Anteil der Summe der geschädigten Zellen auf beiden Seiten an der Summe der gesamten Zellen. Die Zählung der verblindeten Schnitte wird zweimal durchgeführt und arithmetisch gemittelt. Die Zählung erfolgte durch einen unabhängigen Dritten. 48 2.2.8 Statistik Zur statistischen Auswertung wird der Wilcoxon-Test für unabhängige Stichproben angewendet. Es handelt sich um einen parameterfreien Test, und er ist identisch mit dem Kruskal-Vallis-Test für zwei Gruppen. Er findet Anwendung, wenn nicht sicher davon ausgegangen werden kann, dass die Daten normalverteilt sind. Er ist robust gegen Ausreißer nach oben bzw. unten. Herausgefunden werden soll, ob in der Kontrollgruppe eine signifikant höhere Zellschädigung vorliegt als in der Verumgruppe. Der Test wird dazu auf den Anteil von geschädigten Zellen in der Verumgruppe und den Anteil von geschädigten Zellen in der Kontrollgruppe angewendet. Insgesamt erfolgen zwei Anwendungen, einmal für den postischämischen Versuchsarm – jeweils mit Verum und Kontrolle – und anschließend für den präischämischen Versuchsarm – ebenfalls mit Verum und Kontrolle. Als unterstützende Software wird das Statistikprogramm SAS Version 12.0 verwendet. 49 3 Resultate 3.1 Zellläsionen Insgesamt 50 Tiere werden in die Versuche eingeschlossen. Die Verteilung sieht wie folgt aus: Die Gruppe, die präischämisch 1µg/5µl Baclofen erhält (n=12), wird gegen die Kontrollgruppe verglichen, welche präischämisch 5µl NaCl erhält (n=11). Die Ergebnisse sind in den Abb. 38 und 39a und b dargestellt, wobei die Charakterisierung der Gruppen zur präziseren Darstellung der Verteilung in Boxplots vorgenommen wurde. Die Gruppe, welche postischämisch 2µg/5µl Baclofen erhält (n=16), wird gegen die Kontrollgruppe verglichen, welche postischämisch 5µl NaCl erhält (n=11). Diese Ergebnisse finden sich in den Abb. 40 und 41a und b, in letzterer ebenfalls wieder mit Boxplot-Darstellung. Auf der x-Achse sind Versuchstiere aufgetragen: Die Nummern der Versuchstiere entsprechen nicht jenen in den Laboraufzeichnungen, vielmehr sind sie zur besseren Übersicht nach zunehmender Zellschädigung sortiert. Die linke Säule im Diagramm stellt das Tier aus der Verum-Gruppe dar (blau), die rechte Säule bezeichnet das Tier aus der Kontrollgruppe (rot). Auf der y-Achse findet sich der prozentuale Anteil an geschädigten Neuronen im CA1- bis CA3-Band. 50 Abb. 38: Präischämische Applikation von 1µg/5µl Baclofen in der Verum-Gruppe (12 Tiere) versus 5µl NaCl in der Kontrollgruppe (11 Tiere) Die Zahl der geschädigten Zellen ist in der Verum-Gruppe signifikant größer (p=0,021) als in der Plazebo-Gruppe. Eine Darstellung mit Boxplots findet sich in den nachfolgenden Abb. 39a und 40b. 51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Anteil geschädigter hippokampaler Pyramidenzellen (aufsteigend sortiert) im Präischämieversuch (p=0,021) Verum-Gruppe Kontrollgruppe Nummer des Versuchstieres A n te il g e s ch ä d ig te r Z e lle n [% ] Abb. 39a und b: Präischämische Applikation: Darstellung der hippokampalen Zellschädigung mit Boxplots. Die Schädigungsbreite beträgt 77,85% vs. 70,8%, der Median 74,05% vs. 39,6% (Mittelwerte: 77,9% vs. 44,5%, nicht eingezeichnet). Die 75. Perzentile liegt bei 84,94% vs. 56,61%, die 25. Perzentile bei 60,43% vs. 23,7%. Die maximale Schädigung erreicht 94,3% vs. 89,0%, minimal geschädigt sind 18,45% vs. 18,2%. Die Standardabweichung beträgt 22,13% vs. 23,41%. Die Schädigung in der Verum-Gruppe ist signifikant erhöht (p=0,021). Ganz anders sehen die Resultate im Postischämieversuch aus. Dort scheint die applizierte Menge von Baclofen keinen signifikanten Effekt (p=0,093) auf den Anteil der geschädigten Zellen zu haben: 52 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Verum-Gruppe Präischämieversuch A n te il g e s ch ä d ig te r Z e lle n [% ] 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Kontrollgruppe Präischämieversuch A n te il g e s ch ä d ig te r Z e lle n [% ] Abb. 40: Postischämische Applikation von 2µg/5µl Baclofen in der Verum-Gruppe (16 Tiere) versus 5µl NaCl in der Kontrollgruppe (11 Tiere) Eine Darstellung mit Boxplots findet sich in den nachfolgenden Abb. 41a und b. 53 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0 20 40 60 80 100 Anteil geschädigter hippokampaler Pyramidenzellen (aufsteigend sortiert) im Postischämieversuch (p=0,093) Verum-Gruppe Kontrollgruppe Nummer des Versuchstieres A n te il g e s ch ä d ig te r Z e lle n [% ] 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Postischämieversuch Kontrollgruppe A n te il g e s ch ä d ig te r Z e lle n [% ] 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Postischämieversuch Verum-Gruppe A n te il g e s ch ä d ig te r Z e lle n [% ] Abb. 41a und b: Postischämische Applikation: Darstellung der hippokampalen Zellschädigung mit Boxplots. Die Schädigungsbreite beträgt 64,85% vs. 78,9%, der Median 26,6% vs. 48,6% (Mittelwerte: 39,3% vs. 57,2%, nicht eingezeichnet). Die 75. Perzentile liegt bei 64,16% vs. 72,09%, die 25. Perzentile bei 15,18% vs. 40,14%. Die maximale Schädigung erreicht 77,1% vs. 100%, minimal geschädigt sind 12,25% vs. 21,1%. Die Standardabweichung beträgt 24,40% vs. 25,36% Die Schädigungsdiskrepanz erreicht kein Signifikanzniveau (p=0,093). 54 Im Folgenden die detaillierten Ergebnisse der hippokampalen Zellschädigung [%] gemäß der im Methodenteil erwähnten Auswertung. Die Versuchstiernummer entspricht hier derjenigen in den Experimenten und ist daher innerhalb einzelnen Versuchsserien chronologisch: Versuchstier N= Präischämisch (Verum-Gruppe) Präischämisch (Kontrollgruppe) Postischämisch (Verum-Gruppe) Postischämisch (Kontrollgruppe) 1 93,75 21,9 15,4 59,00 2 82,65 39,6 14,5 94,47 3 69,7 62,3 63,1 48,60 4 18,45 47,2 73,25 60,57 5 46,2 38,8 12,5 100,00 6 91,8 75,4 42,5 42,90 7 74,9 18,2 67,35 40,68 8 94,3 20,86 77,1 39,60 9 54,8 25,5 34,2 38,90 10 77,15 89 25,2 21,10 11 73,2 50,92 12,95 83,60 12 62,3 12,25 13 51,2 14 71,05 15 24,1 16 32,15 55 3.2 Mittlerer arterieller Blutdruck (Mean arterial blood pressure, MABP) Der Ausgangs-MABP bei Kanülierung der A. femoralis bewegt sich im Bereich von 59 bis 124mmHg (97,14mmHg), der MABP nach Okklusion der Aa. vertebrales im Bereich von 68 bis 127mmHg (95,62mmHg) bei allen Tieren. Hier gibt es keine signifikanten Unterschiede in den Gruppen. In der Präischämiegruppe haben die Verum-Tiere einen signifikant niedrigeren MABP als die Plazebo-Tiere direkt nach Injektion; die Differenz beträgt im Mittel 11,92mmHg. In der Postischämiegruppe haben die Verum-Tiere ebenfalls einen signifikant niedrigeren MABP als in der Plazebo-Gruppe nach Injektion; hier beträgt die Differenz 17,50mmHg. Dieser Unterschied bleibt zu weiteren Messzeitpunkten bis zum Versuchsende bestehen. Die Darstellung der Mittelwerte wurde in den nachfolgenden Diagrammen vorgenommen (Abb. 42 und Abb. 43). Zu den einzelnen Messzeitpunkten T = 1 bis 7 wurden die korrespondierenden Boxplots dargestellt (Abb. 42a-g und 43a-g). 56 Präischämische Applikation: mittlerer arterieller Blutdruck (MABP) 0 50 100 150 1 2 3 4 5 6 7 MABP zu den Zeiten T= M A B P [ m m H g ] Verum-Gruppe Kontrollgruppe Abb. 42: Mittelwerte der MABP im präischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten T = 1 (Einbringen des Katheters in die A. femoralis), T = 2 (Verschluss der Aa. vertebrales), T = 3 (direkt vor Baclofenapplikation), T = 4 (direkt nach Baclofenapplikation), T = 5 (bei Verschluss der Aa. carotides communes), T = 6 (5min nach Verschluss der Aa. carotides communes) und T = 7 (am Versuchsende). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 4 5 6 7 Messzeitpunkt 97,75 93,75 105,67 93,75 94,75 121,42 92,33 Verum-Gruppe 94,18 89,60 80,20 90,00 113,60 113,80 86,80 Kontrollgruppe Zu den einzelnen Messzeitpunkten (T = 1 bis 7) sind die jeweiligen Versuchsgruppen als Boxplot einander gegenübergestellt (Abb. 42a-g). Um der Übersichtlichkeit willen wurden die Einheiten, die sich aus den Abbildungen ergeben, weggelassen. 57 0 20 40 60 80 100 120 140 Präischämieversuch Verumgruppe M A B P 1 [ m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 Präischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 1 [m m H g ] Abb. 42a Standardabweichung: 17,64 vs. 11,04 Minimum: 59 vs. 80 Unteres Quartil: 85,75 vs. 85 Median: 101,5 vs. 92 Oberes Quartil: 108,5 vs. 102 Maximum: 120 vs. 112 58 0 20 40 60 80 100 120 Präischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 2 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 Präischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 2 [m m H g ] Abb. 42b Standardabweichung: 13,55 vs. 11,65 Minimum: 70 vs. 80 Unteres Quartil: 86 vs. 80 Median: 95 vs. 84 Oberes Quartil: 102,5 vs. 96 Maximum: 111 vs. 112 59 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 3 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Kontroll-Gruppe M A B P 3 [m m H g ] Abb. 42c Standardabweichung: 15,68 vs. 11,75 Minimum: 87 vs. 65 Unteres Quartil: 98 vs. 73,5 Median: 102 vs. 80 Oberes Quartil: 111 vs. 86 Maximum: 141 vs. 100 60 0 20 40 60 80 100 120 140 Präischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 4 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 Präischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 4 [m m H g ] Abb. 42d Standardabweichung: 14,50 vs. 12,82 Minimum: 72 vs. 72 Unteres Quartil: 87 vs. 81 Median: 94,5 vs. 88 Oberes Quartil: 99,25 vs. 97 Maximum: 125 vs. 112 61 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 5 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 5 [m m H g ] Abb. 42e Standardabweichung: 29,31 vs. 10,53 Minimum: 54 vs. 92 Unteres Quartil: 79 vs. 109 Median: 92 vs. 114 Oberes Quartil: 101,5 vs. 120 Maximum: 146 vs. 128 62 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 6 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 6 [m m H g ] Abb. 42f Standardabweichung: 14,66 vs. 15,68 Minimum: 90 vs. 84 Unteres Quartil: 116,25 vs. 103 Median: 123 vs. 118 Oberes Quartil: 126,25 vs. 127 Maximum: 150 vs. 130 63 0 20 40 60 80 100 120 140 Präischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 7 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 Präischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 7 [m m H g ] Abb. 42g Standardabweichung: 16,09 vs. 19,78 Minimum: 65 vs. 56 Unteres Quartil: 82,75 vs. 74 Median: 88,5 vs. 90 Oberes Quartil: 102 vs. 92 Maximum: 123 vs. 128 64 Postischämische Applikation: mittlerer arterieller Blutdruck (MABP) 0 50 100 150 1 2 3 4 5 6 7 MABP zu den Zeitpunkten T= M A B P [ m m H g ] Verum-Gruppe Kontrollgruppe Abb. 43: Mittelwerte der MABP im postischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Einbringen des Katheters in die A. femoralis), 2 (Verschluss der Aa. vertebrales), 3 (bei Verschluss der Aa. carotides communes), 4 (5min nach Verschluss der Aa. carotides communes), 5 (direkt vor Baclofenapplikation und 30min nach 4VO), 6 (direkt nach Baclofenapplikation und 35min nach 4VO) und 7 (am Versuchsende). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 4 5 6 7 Messzeitpunkt 101,75 105,31 108,50 128,88 113,81 96,31 86,62 Verum-Gruppe 93,08 89,58 119,18 117,55 96,90 98,50 103,56 Kontrollgruppe 65 0 20 40 60 80 100 120 140 Postischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 1 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 Postischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 1 [m m H g ] Abb. 43a Standardabweichung: 13,19 vs. 13,81 Minimum: 75 vs. 64 Unteres Quartil: 93,75 vs. 86,5 Median: 96,5 vs. 92 Oberes Quartil: 112 vs. 98 Maximum: 124 vs. 120 66 0 20 40 60 80 100 120 140 Postischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 2 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 Postischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 2 [m m H g ] Abb. 43b Standardabweichung: 13,48 vs. 10,16 Minimum: 87 vs. 68 Unteres Quartil: 93,75 vs. 83,5 Median: 104,5 vs. 90 Oberes Quartil: 112 vs. 98 Maximum: 133 vs. 100 67 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 3 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 3 [m m H g ] Abb. 43c Standardabweichung: 13,51 vs. 15,42 Minimum: 86 vs. 95 Unteres Quartil: 94,5 vs. 107 Median: 111 vs. 118 Oberes Quartil: 118,5 vs. 134 Maximum: 128 vs. 144 68 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Postischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 4 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Postischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 4 [m m H g ] Abb. 43d Standardabweichung: 12,86 vs. 20,67 Minimum: 109 vs. 88 Unteres Quartil: 119 vs. 107,75 Median: 128 vs. 118 Oberes Quartil: 138 vs. 131 Maximum: 152 vs. 156 69 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 5 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 5 [m m H g ] Abb. 43e Standardabweichung: 12,48 vs. 22,50 Minimum: 78 vs. 75 Unteres Quartil: 111,25 vs. 80 Median: 115 vs. 90 Oberes Quartil: 120 vs. 115 Maximum: 134 vs. 140 70 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Veum-Gruppe M A B P 6 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 6 [m m H g ] Abb. 43f Standardabweichung: 12,38 vs. 22,10 Minimum: 72 vs. 75 Unteres Quartil: 91,75 vs. 85 Median: 100 vs. 96 Oberes Quartil: 103 vs. 115 Maximum: 119 vs. 140 71 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Verum-Gruppe M A B P 7 [m m H g ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Kontrollgruppe M A B P 7 [m m H g ] Abb. 43g Standardabweichung: 24,54 vs. 19,71 Minimum: 45 vs. 88 Unteres Quartil: 80 vs. 92 Median: 88 vs. 102,5 Oberes Quartil: 104 vs. 112,5 Maximum: 120 vs. 145 72 3.3 Rektaltemperatur Die Rektaltemperatur kann sowohl in der Prä- als auch in der Postischämiegruppe bei jedem einzelnen Tier zu den drei Zeitpunkten Versuchsbeginn, intraischämisch und bei Versuchsende zwischen 36,5°C und 37,5°C konstant gehalten werden. Einzige Ausnahme ist ein Tier aus der präischämischen Kontrollgruppe: Intraischämisch beträgt hier die Temperatur 36,4°C. Im Mittel liegen die Temperaturen zwischen 36,7°C und 37,2°C. Die Darstellung der Mittelwerte zu allen Zeitpunkten wurde in den nachfolgenden Diagrammen vorgenommen (Abb. 44 und Abb. 45). Präischämische Applikation: Rektaltemperatur 36,2 36,4 36,6 36,8 37 37,2 37,4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Messzeitpunkt T= R e k ta lt e m p e ra tu r [° C ] Verum-Gruppe Kontrollgruppe Abb. 44: Mittelwerte der rektalen Temperaturen (Körperkerntemperatur) im präischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Einbringen des Katheters in die A. femoralis), 2 (Verschluss der Aa. vertebrales), 3 (direkt vor Baclofenapplikation), 4 (direkt nach Baclofenapplikation), 5 (bei Verschluss der Aa. carotides communes), 6 (5min nach Verschluss der Aa. carotides communes), 7 (10min nach Verschluss der Aa. carotides communes, also direkt postischämisch), 8 (30min post 4VO) und 9 (60min post 4VO, Versuchsende). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Messzeitpunkt 36,82 36,65 36,84 36,75 36,81 36,90 37,03 36,75 36,80 Verum-Gruppe 36,96 36,98 37,01 37,11 36,80 36,71 36,77 36,77 36,95 Kontrollgruppe 73 Postischämische Applikation: Rektaltemperatur 36,20 36,40 36,60 36,80 37,00 37,20 37,40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Messzeitpunkt T= R e k ta lt e m p e ra tu r [° C ] Verum-Gruppe Kontrollgruppe Abb. 45: Mittelwerte der rektalen Temperaturen (Körperkerntemperatur) im postischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Einbringen des Katheters in die A. femoralis), 2 (Verschluss der Aa. vertebrales), 3 (bei Verschluss der Aa. carotides communes), 4 (5min nach Verschluss der Aa. carotides communes), 5 (10min nach Verschluss der Aa. carotides communes, also direkt postischämisch), 6 (direkt vor Baclofenapplikation, also 30min post 4VO), 7 (direkt nach Baclofenapplikation, also 35min post 4VO), 8 (60min post 4VO) und 9 (90min post 4VO, Versuchsende). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Messzeitpunkt 36,98 36,84 36,94 37,11 37,09 36,86 36,90 36,75 36,98 Verum-Gruppe 36,94 37,05 36,90 36,87 37,14 37,23 37,15 36,77 36,84 Kontrollgruppe 74 3.4 Intrakranielle Temperatur Wie bereits im Methodenteil erwähnt, wurde die intrakranielle Temperatur näherungsweise über eine Temperatursonde im M. temporalis bestimmt. In der postischämischen Kontroll- und der präischämischen Verumgruppe liegt die Temperatur bei allen Tieren im Bereich von 36,8 bis 37,2°C. Ausnahmen hiervon gibt es bei drei Tieren der präischämischen Kontrollgruppe (37,3°C, 37,3°C und 37,5°C) und bei drei Tieren der postischämischen Verumgruppe (37,3°C, 37,5°C und 37,5°C). Die Darstellung der Mittelwerte wurde in den nachfolgenden Diagrammen vorgenommen (Abb. 46 und Abb. 47). Präischämische Applikation: Intrakranielle Temperatur 36,8 36,9 37 37,1 37,2 37,3 1 2 3 Messzeitpunkt T= In tr a k ra n ie ll e T e m p e ra tu r [° C ] Verum-Gruppe Kontrollgruppe Abb. 46: Darstellung des intraischämischen Verlaufs der intrakraniellen Temperatur im präischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Beginn der Ischämie), 2 (5’ post 4VO) und 3 (Ende der Ischämie, 10’ post 4VO). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 Messzeitpunkt 36,98 36,88 37,01 Verum-Gruppe 37,15 37,21 37,21 Kontrollgruppe 75 Postischämische Applikation: Intrakranielle Temperatur 36,8 36,9 37 37,1 37,2 37,3 1 2 3 Messzeitpunkt T= In tr a k ra n ie ll e T e m p e ra tu r [° C ] Verum-Gruppe Kontrollgruppe Abb. 47: Darstellung des intraischämischen Verlaufs der intrakraniellen Temperatur im postischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Beginn der Ischämie), 2 (5’ post 4VO) und 3 (Ende der Ischämie, 10’ post 4VO). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 Messzeitpunkt 37,10 37,05 37,03 Verum-Gruppe 37,25 37,27 37,12 Kontrollgruppe 76 3.5 Blutglukosespiegel aus der Femoralarterie Präischämiegruppe. Hier sind die Blutglukosewerte zum Messzeitpunkt 1 bei Kanülierung der A. femoralis nicht signifikant unterschiedlich (p=0,389). Die Werte bei den Kontroll- und Verumtieren (n=23) liegen zwischen 75mg/dl und 149mg/dl (106,09mg/dl). Ein signifikanter Unterschied stellt sich zum Messzeitpunkt 2 (n=22) vor Baclofengabe dar (p=0,041), wo die Werte zwischen 39 und 149mg/dl streuen (97,82mg/dl) und am Ende des Versuchs (n=19) zum Messzeitpunkt 3 (p=0,045). Hier liegen die Werte zwischen 47 und 152mg/dl (99,11mg/dl). Postischämiegruppe. Hier ergeben sich zu keinem Messzeitpunkt signifikante Unterschiede. Zu Versuchsbeginn (Messzeitpunkt 1, n=28, p=0,352) liegen die Werte zwischen 56 und 142mg/dl (92,79mg/dl). Zum Messzeitpunkt 2 (n=24, p=0,121) liegen die Werte im Bereich von 47 bis 139mg/dl (85,17mg/dl). Zum Messzeitpunkt 3 (n=17, p=0,596) streuen die Werte von 70 bis 119mg/dl (87,29mg/dl). Die Darstellung der Mittelwerte gemäß dem o. g. Schema (Abb. 33) wurde in den nachfolgenden Diagrammen vorgenommen (Abb. 48 und Abb. 49). Zu den einzelnen Messzeitpunkten T = 1 bis 3 wurden die korrespondierenden Boxplots dargestellt (Abb. 48a-c und Abb. 49a-c). 77 Präischämische Applikation: Blutglucose 80 90 100 110 120 1 2 3 Messzeitpunkt T= G lu k o s e s p ie g e l [m g /d l] Verum-Gruppe Kontrollgruppe Abb. 48: Darstellung Verlaufs des Blutglukosespiegels über den ganzen Versuch im präischämischen Arm hinweg zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Kanülierung der Femoralarterie), 2 (prä Bac) und 3 (Versuchsende). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 Messzeitpunkt 103,25 88,17 84,67 Verum-Gruppe 109,18 109,40 109,90 Kontrollgruppe 78 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Verum-Gruppe B lu tg lu ko s e p ie g e l T = 1 [m g /d l] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Kontrollgruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 1 [m g /d l] Abb. 48a Standardabweichung: 22,69 vs. 19,65 Minimum: 75 vs. 82 Unteres Quartil: 91,25 vs. 96,5 Median: 96 vs. 105 Oberes Quartil: 112 vs. 121,5 Maximum: 146 vs. 149 79 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Verum-Gruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 2 [m g /d l] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Kontrollgruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 2 [ m g /d l] Abb. 48b Standardabweichung: 23,69 vs. 20,45 Minimum: 39 vs. 72 Unteres Quartil: 78,75 vs. 94,5 Median: 88,5 vs. 114 Oberes Quartil: 101,5 vs. 120,5 Maximum: 124 vs. 140 80 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Verum-Gruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 3 [m g /d l] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Präischämieversuch Kontrollgruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 3 [m g /d l] Abb. 48c Standardabweichung: 22,78 vs. 22,43 Minimum: 47 vs. 76 Unteres Quartil: 73 vs. 93 Median: 95 vs. 114 Oberes Quartil: 106 vs. 120,75 Maximum: 111 vs. 152 81 Postischämische Applikation: Blutglucose 80 90 100 110 120 1 2 3 Messzeitpunkt T= G lu k o s e s p ie g e l [m g /d l] Verum-Gruppe Kontrollgruppe Abb. 49: Darstellung Verlaufs des Blutglukosespiegels über den ganzen Versuch im postischämischen Arm hinweg zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Kanülierung der Femoralarterie), 2 (prä Bac) und 3 (Versuchsende). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 Messzeitpunkt 90,69 80,07 81,25 Verum-Gruppe 95,58 92,30 93,38 Kontrollgruppe 82 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Verum-Gruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 1 [m g /d l ] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Kontrollruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 1 [m g /d l] Abb. 49a Standardabweichung: 22,26 vs. 20,62 Minimum: 56 vs. 56 Unteres Quartil: 76,5 vs. 81 Median: 84 vs. 89 Oberes Quartil: 109 vs. 112,5 Maximum: 142 vs. 125 83 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Verum-Gruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 2 [m g /d l] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Postischämieversuch Kontrollgruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 2 [m g /d l] Abb. 49b Standardabweichung: 27,45 vs. 18,80 Minimum: 43 vs. 68 Unteres Quartil: 66,25 vs. 73 Median: 74 vs. 90 Oberes Quartil: 87,75 vs. 107 Maximum: 139 vs. 110 84 0 20 40 60 80 100 120 140 Postischämieversuch Verum-Gruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 3 [m g /d l] 0 20 40 60 80 100 120 140 Postischämieversuch Kontrollgruppe B lu tg lu ko s e s p ie g e l T = 3 [m g /d l] Abb. 49c Standardabweichung: 7,88 vs. 21,41 Minimum: 70 vs. 70 Unteres Quartil: 80 vs. 74 Median: 82 vs. 77 Oberes Quartil: 85 vs. 112,5 Maximum: 98 vs. 119 85 3.6 Kohlendioxid-Partialdruck (pCO2) Präischämiegruppe. Im hier beschriebenen Versuch mit nur 1µg/5µl Baclofen keine ausgeprägte Hyperkapnie zu beaobachten. Im Gegenteil: Die Verum-Gruppe hat während des gesamten Experiments Kohlendioxidpartialdrucke, die im Mittel unterhalb denen der Kontrollgruppe liegen. Zu Beginn ist dieser Unterschied noch nicht signifikant (p=0,163), zum Versuchsende hin jedoch ist der pCO2 der präischämischen Verum-Gruppe signifikant erniedrigt (p=0,013). In der Verum-Gruppe liegen die Werte des pCO2 zwischen 31 und 45mmHg (T=1), 26 und 46mmHg (T=2), 35 und 51mmHg (T=3), 23 und 81mmHg (T=4), 28 und 52mmHg (T=5) sowie 40 und 50mmHg (T=6). In der Kontrollgruppe liegen die Werte des pCO2 zwischen 31 und 48mmHg (T=1), 31 und 50mmHg (T=2), 39 und 62mmHg (T=3), 41 und 62mmHg (T=4), 42 und 71mmHg (T=5) sowie 43 und 62mmHg (T=6). Postischämiegruppe. Auch hier liegen die Daten der Verum-Gruppe fast ausnahmslos (bis auf T=5) unterhalb der Kontrollgruppe. Signifikante Unterschiede ergeben sich jedoch nicht, weder zu Versuchsbeginn (p=0,399) noch zu Versuchsende (p=0,165). Allerdings scheint sich hier die Beobachtung widerzuspiegeln, dass nach Baclofenapplikation der diesmal höheren Menge (2µg/5µl) durchaus eine relevante pCO2- Erhöhung von im Mittel 38,71mmHg auf 49,92mmHg zu verzeichnen ist. Diese Beobachtung deckt sich also mit der Hyperkapnie der Verum- Gruppe im präischämischen Arm nach Baclofenapplikation bei Herrn Ludolph, welche für eine höhere Zellschädigung verantwortlich gemacht wird, mit der Einschränkung, dass diese Bewegung auch in der Kontrollgruppe vollzogen wird. 86 In der Verum-Gruppe liegen die Werte zwischen 32 und 55mmHg (T=1), 27 und 44mmHg (T=2), 18 und 50mmHg (T=3), 28 und 60mmHg (T=4), 27 und 74mmHg (T=5) sowie 35 und 61mmHg (T=6). In der Kontrollgruppe liegen die Werte des pCO2 zwischen 33 und 52mmHg (T=1), 30 und 51mmHg (T=2), 20 und 46mmHg (T=3), 35 und 58mmHg (T=4), 41 und 58mmHg (T=5) sowie 38 und 74mmHg (T=6). Die Darstellung der Mittelwerte wurde in den nachfolgenden Diagrammen vorgenommen (Abb. 50 und Abb. 51). In Form von Boxplots wurden zu Beginn (T=1, Abb. 50a) und zum Ende des Präischämie-Versuchs (T=6, Abb. 50b) sowie zu Beginn und Ende des Postischämieversuchs (Abb. 51a und b) die Kohlendioxidpartialdrücke dargestellt und zueinander in Bezug gesetzt. 87 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 Präischämieversuch Kohlendioxidpartialdruck Verum-Gruppe Kontrollgruppe Messzeitpunkt T = K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] Abb. 50: Mittelwerte der pCO2-Werte im präischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Einbringen des Katheters in die A. femoralis), 2 (bei Verschluss der Aa. carotides communes), 3 (5min nach Verschluss der Aa. carotides communes), 4 (10min nach Verschluss der Aa. carotides communes, also direkt postischämisch), 5 (30min post 4VO) und 6 (60min post 4VO, Versuchsende). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 4 5 6 Messzeitpunkte 38,50 37,92 42,08 39,82 44,13 45,25 Verum-Gruppe 40,84 41,02 44,41 49,53 50,15 50,83 Kontrollgruppe 88 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Verum-Gruppe zu Beginn des Präischämieversuchs K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Kontrollgruppe zu Beginn des Präischämieversuchs K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] Abb. 50a Standardabweichung: 4,36 vs. 4,38 Minimum: 31 vs. 31 Unteres Quartil: 36,25 vs. 40 Median: 39 vs. 42 Oberes Quartil: 42 vs. 43 Maximum: 45 vs. 48 89 0 10 20 30 40 50 60 70 Verum-Gruppe zum Ende des Präischämieversuchs K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] 0 10 20 30 40 50 60 70 Kontrollgruppe zum Ende des Präischämieversuchs K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] Abb. 50b Standardabweichung: 7,09 vs. 5,52 Minimum: 28 vs. 43 Unteres Quartil: 39,25 vs. 47,75 Median: 44,5 vs. 50 Oberes Quartil: 47,5 vs. 53,25 Maximum: 52 vs. 62 90 Abb. 51: Mittelwerte der pCO2-Werte im postischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Einbringen des Katheters in die A. femoralis), 2 (bei Verschluss der Aa. carotides communes), 3 (5min nach Verschluss der Aa. carotides communes), 4 (direkt vor Baclofenapplikation, also 30min post 4VO), 5 (nach Baclofenapplikation, 60min post 4VO) und 6 (90min post 4VO, Versuchsende). Die Werte sind im Einzelnen: 1 2 3 4 5 6 Messzeitpunkte 38,40 32,25 32,25 38,71 49,92 47,63 Verum-Gruppe 39,33 40,96 34,55 45,64 49,44 50,15 Kontrollgruppe 91 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 Postischämieversuch Kohlendioxidpartialdruck Verum-Gruppe Kontrollgruppe Messzeitpunkt T = K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] 0 10 20 30 40 50 60 Verum-Gruppe zu Beginn des Postischämieversuchs K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] 0 10 20 30 40 50 60 Kontrollgruppe zu Beginn des Postischämieversuchs K o h le n d io d ip a rt ia ld ru ck [m m H g ] Abb. 51a Standardabweichung: 5,51 vs. 5,11 Minimum: 32 vs. 33 Unteres Quartil: 34 vs. 36 Median: 37,5 vs. 39 Oberes Quartil: 39,5 vs. 41,5 Maximum: 55 vs. 62 92 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Verum-Gruppe zum Ende des Postischämieversuchs K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Kontrollgruppe zum Ende des Postischämieversuchs K o h le n d io xi d p a rt ia ld ru ck [m m H g ] Abb. 51b Standardabweichung: 12,57 vs. 11,43 Minimum: 27 vs. 41 Unteres Quartil: 31 vs. 45,5 Median: 42 vs. 48 Oberes Quartil: 50,5 vs. 54,5 Maximum: 65 vs. 74 93 3.7 Sauerstoff-Partialdruck (pO2) Zu allen Zeitpunkten ist der pO2 der Kontrollgruppe sowie der Verum- Gruppe – in beiden Versuchsarmen – deutlich über 60mmHg. Der niedrigste pO2-Wert tritt bei der postischämischen Applikations zum Zeitpunkt T6 in der Verumgruppe auf. Insbesondere zu den Zeitpunkten der Ischämie und der Baclofenapplikation befindet sich der pO2 in einem Bereich, in dem auf der O2-Bindungskurve eine Sättigung von über 97% postuliert wird. pO2-Schwankungen ab 60mmHg werden mit einer dann anzunehmenden O2-Sättigung von über 90% als nicht relevant erachtet. Der Verlauf ist parallelverschoben: Im Präischämie-Arm zeigt sich über den ganzen Versuch hinweg bei allen Tieren ein kontinuierlicher Abfall des O2-Partialdruckes um 14,58mmHg vom Beginn des Experiments bis zum Ende (präischämischer Arm, Verum-Gruppe), um 33,49mmHg (präischämischer Arm, Kontrollgruppe) und um 35,84mmHg (postischämischer Arm, Verumgruppe). Eine Ausnahme bildet die Kontrollgruppe des postischämischen Armes: Hier findet sich zwar auch ein globaler Abfall um 7,13mmHg, jedoch ist der Abfall mit einem lokalen Minimum bei T=4 mit 27,87mmHg deutlich größer; hiernach erholt sich der pO2 wieder, um zum Versuchsende zu einem Mittelwert von 153,88mmHg mit oben beziffertem globalen Abfall zu kommen. Die Darstellung der Mittelwerte wurde in den nachfolgenden Diagrammen vorgenommen (Abb. 52 und Abb. 53). In Form von Boxplots wurden zu Beginn (T=1, Abb. 52a) und zum Ende des Präischämie-Versuchs (T=6, Abb. 52b) sowie zu Beginn und Ende des Postischämieversuchs (Abb. 53a und b) die Sauerstoffpartialdrücke dargestellt und zueinander in Bezug gesetzt. 94 Abb. 52: Mittelwerte der pO2-Werte im präischämischen Versuchsarm zu den aus dem Schema (Abb. 33) ersichtlichen Zeitpunkten 1 (Einbringen des Katheters in die A. femoralis), 2 (bei Verschluss der Aa. carotides c