Regulation of flagellation patterns by FlhF and FlhG: analysis of interaction networks in Shewanella putrefaciens and Bacillus subtilis
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Flagella are organelles of locomotion that allow bacteria to respond to changes in the environment by moving toward an attractant or away from repellents. The flagellum is a complex machinery with a conserved architecture. Intracellularly, the basal body consists of the stator and rotor complex, which generates the rotation/torque, and a type 3 flagellar secretion system, which is required for the export of extracellular proteins. The peptidoglycan layer and the outer membrane are spanned by the rod, which transmits the rotation to the extracellular hook. Finally, the hook transmits the rotation to the filament and the cell moves. Unlike the architecture, the distribution pattern of flagella is species-specific. Localization can be restricted to the pole or lateral sides of the cell, and the number can vary from one to nearly 100. These patterns must undergo several regulatory mechanisms to be maintained through the generations. In several species, the proteins FlhF and FlhG have been implicated in the regulation of the flagellar pattern. FlhF belongs to the group of SRP-GTPases and forms a GTP-dependent homodimer with the conserved NG domain. The other protein, FlhG, is a MinD-like ATPase and is located downstream of the flhf gene. When ATP is bound, the proteins form a homodimer and are able to bind to the membrane. FlhG has an additional activator helix at its N-terminus, which can bind FlhF and stimulate GTPase activity. In polar flagellated bacteria such as Shewanella putrefaciens, FlhF is required for correct localization of the flagellum, whereas FlhG regulates the number of flagella. In the peritrichously flagellated bacterium Bacillus subtilis, both proteins are required for proper distribution: FlhG maintains a minimum distance between the flagella and FlhF keeps the distribution in an organized pattern and away from the poles. However, the mechanism behind this regulation is not fully understood.
This work presents a biochemical and structural characterization of the SRP-GTPase FlhF of the monotrichiously flagellated bacterium S. putrefaciens. The structure of the GDP-bound form of the NG-domain compared to the GTP-bound form provides insight into structural conformational changes upon nucleotide binding and may explain the different targets compared to the other SRP-GTPases FtsY and Ffh. The structure of the previously uncharacterized B-domain of FlhF was also solved and shows an interaction with the C-ring protein FliG. This interaction indicates that FlhF is involved in the hierarchical assembly of the MS- and C-rings of the flagellar basal body.
The simultaneous interaction of FliG and the landmark protein HubP with FlhF could suggest a "diffusion and capture" mechanism by which the first flagellar protein FliF is captured by FlhF-bound FliG, which is recruited to the pole by HubP. This mechanism restricts the assembly of the flagellum to the cell pole and prevents premature C-ring assembly. In the peritrichous flagellated B. subtilis, the regulation is different. There, the cell cycle regulator GpsB was identified as a novel interaction partner of FlhG that phenocopies the deletion of flhG and couples cell wall elongation with flagella biosynthesis.
Flagellen stellen Fortbewegungsorgane dar, welche es Bakterien ermöglichen, auf Veränderungen in der Umwelt zu reagieren. Dies erfolgt durch eine gerichtete Bewegung auf einen Anziehungspunkt zu oder durch eine Bewegung von abstoßenden Faktoren weg. Das Flagellum stellt einen komplexen Mechanismus mit einer konservierten Architektur dar. Intrazellulär besteht der Basalkörper aus dem Stator- und Rotorkomplex, der die Rotation bzw. das Drehmoment erzeugt, sowie einem flagellaren Typ 3 Sekretionssystems, das für den Export von extrazellulären Proteinen erforderlich ist. Die Peptidoglykanschicht und die äußere Membran werden vom Stab überspannt, der die Rotation auf den extrazellulären Haken überträgt. Der Haken überträgt die Rotation schließlich auf das Filament, wodurch die Zelle in Bewegung gesetzt wird. Im Gegensatz zur Architektur ist das Verteilungsmuster der Flagellen artspezifisch. Es kann auf die Pole oder die lateralen Seiten der Zelle beschränkt sein, wobei die Anzahl von einer bis zu fast 100 variieren kann. Um diese Muster über die Generationen hinweg aufrechtzuerhalten, müssen mehrere Regulationsmechanismen greifen. Bei mehreren Arten sind die Proteine FlhF und FlhG an der Regulierung der Flagellenmuster beteiligt. FlhF gehört zur Gruppe der SRP-GTPasen und bildet ein GTP-abhängiges Homodimer mit der konservierten NG-Domäne. Das andere Protein, FlhG, ist eine MinD-ähnliche ATPase und befindet sich stromabwärts des flhf-Gens. Bei Bindung von ATP bilden die Proteine ein Homodimer und sind in der Lage, an die Membran zu binden. Das FlhG weist eine zusätzliche Aktivator-Helix an seinem N-Terminus auf, welche die Bindung an FlhF und die Stimulation der GTPase-Aktivität ermöglicht. In monotrichen Bakterien wie Shewanella putrefaciens ist FlhF für die korrekte Lokalisierung des Flagellums erforderlich, während FlhG die Anzahl der Flagellen reguliert. Bei dem peritrich geflaggten Bakterium Bacillus subtilis sind beide Proteine für die korrekte Verteilung erforderlich. Das Protein FlhG sorgt für einen Mindestabstand zwischen den Geißeln, während das Protein FlhF die Verteilung in einem geordneten Muster und weg von den Polen gewährleistet. Der zugrundeliegende Mechanismus ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt.
In der vorliegenden Arbeit wird eine biochemische und strukturelle Charakterisierung der SRP-GTPase FlhF aus S. putrefaciens präsentiert. Die Struktur der GDP-gebundenen Form der NG-Domäne im Vergleich zur GTP-gebundenen Form erlaubt Rückschlüsse auf strukturelle Konformationsänderungen bei Nukleotidbindung und könnte die unterschiedlichen Ziele im Vergleich zu den anderen SRP-GTPasen FtsY und Ffh erklären. Die Struktur der bisher uncharakterisierten B-Domäne von FlhF wurde ebenfalls gelöst und zeigt eine Interaktion mit dem C-Ring-Protein FliG. Diese Interaktion lässt den Schluss zu, dass FlhF am hierarchischen Aufbau der MS- und C-Ringe des Geißelbasalkörpers beteiligt ist. Die simultane Interaktion von FliG und dem Landmarkenprotein HubP mit FlhF könnte auf einen „Diffusions- und Einfang“-Mechanismus hindeuten, bei dem das erste flagellare Protein FliF von FlhF-gebundenem FliG eingefangen wird, welche von HubP an den Pol rekrutiert werden. In B. subtilis zeigt sich eine andere Regulation. Dort wurde der Zellzyklusregulator GpsB als neuartiger Interaktionspartner von FlhG identifiziert. GpsB phänokopiert die Deletion von flhG und koppelt die Zellwandsynthese während des Zellwachtums mit der Biosynthese der Flagellen.