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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Die Integration artfremder Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen findet in der Natur ebenso wie im Labor häufig statt, vor allem im Rahmen der Klonierung von Konstrukten im experimentellen Setting, aber auch bei viralen Infektionen mit Retroviren, die in der Lage sind, ihre RNA in das Genom der Wirtszelle zu integrieren. Das Einbringen bakterieller DNA in eukaryotisches Genom ist hingegen kaum beschrieben. Einzelne Untersuchungen zeigen, dass zum Beispiel die Aufnahme bakterieller DNA über den Darmtrakt mittels Ingestion und anschließender Integration für einen begrenzten Zeitraum auch ohne gezielte Transfektions- oder Transduktionsmechanismen im experimentellen Setting möglich ist.
Im Rahmen der Erschaffung der transgenen Mauslinie F2b, in welche ein GFAP-TIMP-1-Konstrukt eingebracht wurde, kam es zu einer akzidentiellen Ko-Integration bakterieller E.-coli-DNA gemeinsam mit dem transgenen Konstrukt. Da diese Mauslinie eine im Vergleich zu den ebenso TIMP-1-transgenen Mauslinen F11 und F60 eigene Pathologie mit ausgeprägter Entzündungsreaktion aufwies, sollte der Einfluss des bakteriellen Abschnitts untersucht werden. Aufgrund der Immunreaktion mit Hochregulation der Zytokine CCL3, CCL4, CXCL1, Il-1ß, Il-6, Il-7 und TNFα, die vor allem den Signalwegen der angeborenen Immunität mittels PRRs wie TLRs zuzuordnen sind, wurden PAMPs wie einzelsträngige RNA, dsRNA und freie DNA genauso wie bakterielle Proteine als mögliche antigene Strukturen und somit Auslöser der beobachteten Immunreaktion angesehen.
Zunächst sollte die eingebrachte Sequenz der bakteriellen DNA genau charakterisiert werden. Es sollte geklärt werden, welchen Abschnitt der E.-coli-DNA das eingebrachte Stück umfasst und in welchem Zusammenhang das unwissentlich integrierte Konstrukt mit dem gewünschten Transgen steht. Zudem war es Ziel der Arbeit herauszufinden, ob die bakterielle DNA in der F2b-Maus transkribiert und auch zu einem Protein translatiert wird. Zuletzt sollte in primären Astrozytenkulturen anhand exemplarisch vom E.-coli-Abschnitt ausgewählter Gene untersucht werden, ob und das dieser Gene zu einer Hochregulation der Zytokine führt, wie sie in der F2b-Maus beobachtet wurde.
Mittels iPCR und multipler Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass ein ca. 11.580 bp langer E.-coli-Abschnitt in die Maus-DNA integriert wurde. Dieser umfasst die Gene von yciT bis anteilig SapB und geht sowohl in 5’- als auch in 3’-Richtung in das ursprünglich für die Integration intendierte GFAP-TIMP-Konstrukt über. Durch überlappende PCRs mit aus RNA-Extrakten der F2b-Mäuse hergestellter cDNA war der bakterielle Abschnitt von SapC bis mod auf RNA-Ebene nachweisbar, der möglicherweise als zusammenhängender Strang transkribiert wird. Für zwei der vier ausgewählten Gene, fab1 und rnb, konnte in E.-coli-Kulturen eine ausreichende Proteinmenge hergestellt werden, um damit eine Immunisierung von Kaninchen zur Antikörperherstellung durchzuführen. Mit diesen aufgereinigten selbst hergestellten Antikörpern konnte die Antigene fab1 und rnb ebenso wie die nativen Proteine in E.-coli-Proteinextrakten detektiert werden. Sowohl fab1 als auch rnb konnten jedoch nicht als Proteine in den F2b-Extrakten nachgewiesen werden. Gleichermaßen zeigte sich auch keine Expression der gesuchten Proteine in den transduzierten Astrozytenkulturen. Die transduzierten primären Astrozytenkulturen wiesen bei der quantitativen Untersuchung auf Zytokine, welche in der F2b-Maus hochreguliert waren, keine signifikanten Unterschiede zu den nicht-transduzierten oder mit Leervektor transduzierten Astrozytenkulturen auf.
Die Abfolge der letztlich integrierten Konstrukte mit je einem GFAP-TIMP-1-Konstrukt an jedem Ende der E.-coli-Sequenz birgt mit dem vorhandenen Promotor die Möglichkeit, dass die bakterielle DNA sowohl in Sense- als auch in Antisense-Richtung abgelesen wird. Somit stehen bakterielle DNA, bakterielle einzelsträngige mRNA (möglicher-weise in Sense- und Antisense-Richtung) genauso wie ein langer zusammenhängender RNA-Strang oder aneinander gelagerte komplementäre RNA-Stränge (sense und anti-sense) als mögliche Antigene für das Auslösen der Immunreaktion zur Diskussion. Die Proteine konnten mittels der selbst hergestellten Antikörper gegen fab1 und rnb nicht als Antigene detektiert werden. Dies könnte daran liegen, dass diese entweder nicht translatiert werden oder nur in Mengen unterhalb der Nachweisgrenze oder in anderer Form – zum Beispiel posttranslationale Modifikationen – für den Antikörper undetektierbar vorliegen. Die Ergebnisse der qPCRs deuten darauf hin, dass die in Sense-Richtung untersuchten Gene nicht für die Immunreaktion der F2b-Maus verantwortlich sind, da keine Hochregulation der entsprechenden Zytokine beobachtet werden konnte.
Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf ein möglicherweise im Laboralltag auftretendes methodisches Problem bei der Erzeugung transgener Tiere hin. Da die Ko-Integration sehr wahrscheinlich auf einer Verunreinigung und versehentlichen Exzision gleichlanger Banden in der Gelextraktion beruht, ist nicht auszuschließen, dass solche Fehlintegrationen häufiger vonstattengehen und Auswirkungen auf die Untersuchungen transgener Mauslinien haben, ohne wissentlich berücksichtigt zu werden. Weiterhin weist die Mauslinie F2b eine Autoimmunreaktion auf, welche in dieser Arbeit in einem ersten Schritt näher eingegrenzt wurde. Weitere Untersuchungen sowohl mit Sense- als auch mit Antisense-Produkten der ausgewählten Gene geben Hinweise darauf, dass ein Antisense-Produkt des Gens SapC eine Zytokinhochregulation triggern könnte. In diesem Zusammenhang geben die Ergebnisse dieser Arbeit Anstoß für neue Untersuchungen zur Entstehung autoimmuner Prozesse und Erkrankungen in Zusammenhang mit dem Kontakt und Vorhandensein bakterieller Antigene.
The integration of foreign nucleic acids into eukaryotic cells occurs frequently in nature as well as in the laboratory, especially in the context of cloning constructs in experimental settings, but also in viral infections with retroviruses capable of integrating their RNA into the host cell genome. The introduction of bacterial DNA into the eukaryotic genome, on the other hand, is scarcely described. Individual studies show, for example, that the uptake of bacterial DNA through the intestinal tract via ingestion and subsequent integration is possible for a limited period even without targeted transfection or transduction mechanisms in experimental settings.
In the context of creating the transgenic mouse line F2b, into which a GFAP-TIMP-1 construct was introduced, accidental co-integration of bacterial E. coli DNA occurred together with the transgenic construct. Since this mouse line exhibited its own pathology compared to the similar TIMP-1-transgenic mouse lines F11 and F60, with a pronounced inflammatory reaction, the influence of the bacterial segment was to be investigated. Due to the immune reaction with upregulation of cytokines CCL3, CCL4, CXCL1, Il-1ß, Il-6, Il-7, and TNFα, which are primarily associated with innate immunity pathways through PRRs such as TLRs, PAMPs such as single-stranded RNA, dsRNA, and free DNA as well as bacterial proteins were possible antigenic structures triggering the observed immune reaction.
First, the exact integrated sequence of the bacterial DNA should be characterized. This included determining which portion of the E. coli DNA the integrated fragment encompassed, as well as the relationship between the unintentionally integrated construct and the intentionally integrated transgene. Additionally, the aim of this dissertation project was to determine whether the bacterial DNA in the F2b mouse is transcribed and translated into a protein. Finally, primary astrocyte cultures were used to investigate whether and which gene present in the E. coli segment leads to upregulation of cytokines as observed in the F2b mouse.
Results: Using iPCR and sequencing, it was shown that an approximately 11.580bp long E. coli segment was integrated into mouse DNA. This included the genes from yciT to partially SapB and extended into both 5’ and 3’ directions into the originally intended GFAP-TIMP construct. By overlapping PCRs on cDNA from RNA extracts of F2b mice, the bacterial segment from SapC to mod was detected at the RNA level, possibly transcribed as a contiguous strand.
For two of the four selected genes, fab1 and rnb, sufficient protein amounts were produced in E. coli cultures to immunize rabbits for antibody production. With purified self-made antibodies, the antigens fab1 and rnb, as well as the native protein in E. coli protein extracts, could be detected. However, neither fab1 nor rnb could be detected as proteins in the F2b extracts. Similarly, no expression of the desired proteins was observed in the transduced astrocyte cultures. The transduced primary astrocyte cultures showed no significant differences in the quantitative examination of cytokines, which were upregulated in the F2b mouse, compared to untransduced or empty-vector-transduced astrocyte cultures.
The sequence of the ultimately integrated constructs, with a GFAP-TIMP-1 construct containing the GFAP promoter at each end of the E. coli sequence, provides the possibility that bacterial DNA is transcribed in both sense and antisense direction. Thus, possible antigens triggering the immune reaction include bacterial DNA, bacterial single-stranded mRNA, possibly in sense and antisense directions, as well as a long contiguous RNA strand or concatenated complementary RNA strands (sense and antisense). The proteins could not be detected as antigens by the self-synthesized antibodies for fab1 and rnb, indicating that they are either not translated or are present below the detection limit or undetected by the antibodies due to post-translational modifications. The qPCR results suggest that the genes investigated in the sense direction are not responsible for the immune reaction in the F2b mouse, as no upregulation of the corresponding cytokines was observed.
The results of this work point to a possible methodological problem encountered in the generation of transgenic animals in everyday laboratory practice. Since co-integration most likely results from contamination and accidental excision of equally long bands in gel extraction, it cannot be ruled out that such misintegrations occur more frequently and have effects on the investigations of transgenic mouse lines without being consciously considered. Furthermore, the F2b mouse line describes an autoimmune reaction, which was narrowed down in this work in a first step. Further investigations on both sense and antisense products of the selected genes suggest that an antisense product of the SapC gene could trigger cytokine upregulation. In this context, the investigations of this work provide impetus for new investigations into the development of autoimmune processes and diseases in relation to the contact and presence of bacterial antigens.
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