Vergleichende Analyse der Sequenzierung des Genoms der 16S ribosomalen RNA in voller Länge in menschlichen Fäkalproben unter Verwendung von Primer-Sets mit unterschiedlichem Degenerationsgrad
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Die Nanopore-Sequenzierung hat in der Mikrobiomforschung bedeutende Fortschritte ermöglicht. Durch ihre Portabilität können Sequenzierungsgeräte in tragbaren Formaten hergestellt werden, was eine Vielzahl von Anwendungen eröffnet. Die Fähigkeit zur Echtzeit-Sequenzierung ermöglicht die direkte DNA- oder RNA-Analyse während des Sequenzierungsprozesses, was sowohl eine beschleunigte Diagnosestellung als auch die dynamische Überwachung biologischer Prozesse unterstützt. Ein wesentlicher Vorteil der Nanopore-Technologie liegt in den langen Leselängen, die eine vollständige Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens ermöglichen. Dies erlaubt eine differenzierte Charakterisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften sowie die Detektion seltener oder schwer sequenzierbarer Mikroorganismen. Die umfassendere Analyse der mikrobiellen Diversität in unterschiedlichen Umgebungen trägt entscheidend dazu bei, die biologischen Prozesse und Interaktionen innerhalb des Mikrobioms präziser zu erfassen und besser zu verstehen.
In der vorliegenden Studie wurde die Leistungsfähigkeit zweier unterschiedlicher Primer-Sets für die vollständige Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens untersucht. Dazu wurden das Primer-Set (27F-I), das Teil des 16S Barcoding-Kit von Oxford Nanopore Technologies ist, und ein stärker degeneriertes Primer-Set (27F-II) miteinander verglichen. Die Analyse umfasste insgesamt 73 Stuhlproben. Es zeigten sich signifikante Unterschiede sowohl in der taxonomischen Vielfalt als auch in den relativen Häufigkeiten zwischen den beiden untersuchten Primer-Sets. Das Primer-Set 27F-I wies eine deutlich geringere Biodiversität auf, mit einer Dominanz von Firmicutes und Proteobakterien sowie einem erhöhten Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes im Vergleich zum stärker degenerierten Primer-Set (27F-II). Das stärker degenerierte Primer-Set 27F-II lieferte eine genauere Repräsentation der mikrobiellen Zusammensetzung, wie sie in westlichen Industriegebieten im Rahmen des American Gut Project dokumentiert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das stärker degenerierte Primer-Set (27F-II) insbesondere für die Analyse des menschlichen Mikrobioms mittels Nanopore-Sequenzierung bevorzugt eingesetzt werden sollte. Die gewonnenen Erkenntnisse könnten die Präzision und Zuverlässigkeit von Mikrobiomstudien erheblich verbessern und dadurch wesentliche Auswirklungen auf die klinische Forschung im Bereich des Mikrobioms haben.
Nanopore sequencing has enabled significant advancements in microbiome research. Its portability allows for the production of sequencing devices in compact formats, opening up a wide range of applications. The real-time sequencing capability facilitates direct DNA or RNA analysis during the sequencing process, supporting both accelerated diagnostics and dynamic monitoring of biological processes. A key advantage of Nanopore technology lies in its ability to generate long read lengths, enabling the complete sequencing of the 16S rRNA gene. This allows for a more detailed characterization of complex microbial communities and the detection of rare or difficult-to-sequence microorganisms. The comprehensive analysis of microbial diversity across various environments significantly contributes to a more precise and deeper understanding of biological processes and interactions within the microbiome.
This investigation assessed the effectiveness of two different primer-sets for full-length sequencing of the 16S rRNA gene. Primer-set 27F-I, included in the Oxford Nanopore Technologies (ONT) 16S Barcoding Kit, was compared with a more degenerate primer-set, 27F-II. A total of 73 stool samples were analyzed. Notable differences in taxonomic diversity and relative abundance were found between the two primer-sets. The 27F-I primer-set showed significantly reduced biodiversity, with a predominance of Firmicutes and Proteobacteria, and a higher Firmicutes-to-Bacteroidetes ratio compared to the more degenerate 27F-II primer-set. The 27F-II set offered a more accurate depiction of the microbial composition found in Western industrialized populations, as outlined in the American Gut Project. These results indicate that the 27F-II primer-set is particularly effective for human microbiome analysis using Nanopore sequencing. The findings from this research could greatly improve the precision and dependability of microbiome
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