Decoding the TP53 mutome: CRISPR perspectives on functional diversity and therapeutic interventions
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
The key transcription factor p53 plays a crucial role in executing diverse tumor suppressive functions in human cells, as evidenced by the high prevalence of mutations in its encoding gene, TP53, across various cancer entities. Remarkably, TP53 mutations predominantly manifest as missense mutations, exhibiting an unparalleled diversity with over 2,000 distinct mutations identified in cancer patients. Notably, about 70% of these mutations remain poorly characterized, highlighting the need for comprehensive understanding to incorporate p53 status into clinical evaluation.
This dissertation focuses on the detailed characterization of more than 94% of reported cancer-associated mutations within the TP53 gene. Employing CRISPR-mediated mutagenesis at the endogenous TP53 locus in cancer cells, we conducted investigations in a highly physiological context. Our research elucidates the functional implications of numerous mutations, previously of uncertain significance, unveiling factors such as moderate thermodynamic destabilization, loss of specific functions, and splicing defects. This knowledge was further implemented into an interactive database, encompassing all
existing analyses on TP53 mutations. This resource facilitates data recapitulation, diverse visualizations, and predictive insights into the tumorigenic potential and therapy response of variants. Exploring clinical targeting of p53, we utilized Designed Ankyrin Repeat Proteins to restore p53 transcriptional activity, exemplified in Human Papilloma Virus-infected cancer cell lines. To incorporate the importance of the tumor microenvironment, we established a highly physiological genetically engineered mouse model for small-cell lung cancer. Therefore, we leveraged adenoviruses for CRISPR-mediated knockout of Trp53 and other cancer-associated genes, resulting in a rapid, flexible, and efficient method for generating cancer mouse models. Moreover, incorporating in vivo labeling with Gaussia princeps luciferase enabled longitudinal and animal-friendly monitoring of tumor development.
In conclusion, this dissertation presents a comprehensive annotation of the TP53 mutome, offering valuable insights into its diverse landscape and clinical implications,
including genetic risk assessment and therapeutic strategies. Additionally, it introduces an advanced method for generating genetically induced cancer mouse models, paving the way for further investigations into the influence of the TP53 mutome on the tumor microenvironment.
Der zentrale Transkriptionsfaktor p53 spielt eine entscheidende Rolle bei der Ausübung
verschiedener tumorsuppressiver Funktionen in menschlichen Zellen, was durch die
hohe Prävalenz von Mutationen in seinem kodierenden Gen, TP53, bei verschiedenen
Krebsarten belegt wird. Bemerkenswerterweise manifestieren sich Veränderungen in
TP53 überwiegend als missense Mutationen und weisen mit über 2.000 verschiedenen,
in Krebspatienten beschriebenen Mutationen, eine unvergleichliche Vielfalt auf. Etwa
70 % dieser Mutationen sind nach wie vor unzureichend charakterisiert, was die
Notwendigkeit eines umfassenden Verständnisses für das TP53 Mutom unterstreicht,
um den p53-Status in die klinische Bewertung einbeziehen zu können.
Diese Dissertation fokussiert sich auf die Charakterisierung von mehr als 94 % der
bekannten krebsassoziierten Mutationen innerhalb des TP53 Gens. Mit Hilfe der
CRISPR-vermittelten Mutagenese des endogenen TP53-Lokus in Krebszellen wurden
Untersuchungen in einem physiologischen Kontext durchgeführt. Dadurch konnten die
funktionellen Auswirkungen zahlreicher Mutationen annotiert werden, deren Bedeutung
zuvor unklar war. Weiterhin konnte der Mechanismus des Funktionsverlustes durch
Faktoren wie eine moderate thermodynamische Destabilisierung, den Verlust
spezifischer Funktionen und Spleißdefekte aufgeklärt werden. Dieses Wissen wurde in
eine interaktive Datenbank implementiert, die alle bisher existierenden Analysen zu
TP53-Mutationen umfasst und so die Rekapitulation von Daten, vielfältige
Visualisierungen und die Vorhersage über die Tumorigenität und das
Therapieansprechen erleichtert. Bei der Erforschung von Therapieoptionen bei p53-
Veränderungen haben wir Designed Ankyrin Repeat Proteine am Beispiel von mit dem
Humanen Papillomavirus infizierten Krebszelllinien eingesetzt, um die
Transkriptionsaktivität von p53 wiederherzustellen.
Um die Bedeutung der Tumormikroumgebung zu berücksichtigen, haben wir ein
physiologisches, genetisch verändertes Mausmodell für kleinzelligen Lungenkrebs
generiert. Dazu haben wir Adenoviren zum CRISPR-vermittelten Knockout von Trp53
und anderen krebsassoziierten Genen genutzt, und damit eine schnelle, flexible und
effiziente Methode zur Erzeugung von Krebsmausmodellen entwickelt. Weiterhin
ermöglichte die in vivo Markierung mit Gaussia princeps Luciferase eine longitudinale
und tierfreundliche Überwachung der Tumorentwicklung.
Zusammenfassend wird in dieser Dissertation eine umfassende Annotation des TP53-
Mutoms gezeigt, welche wertvolle Einblicke in die Vielfältigkeit und mögliche klinische
Anwendung bietet. Darüber hinaus wird eine fortschrittliche Methode zur Erzeugung
genetisch veränderter Krebsmausmodelle vorgestellt, die den Weg für weitere
Untersuchungen zum Einfluss des TP53-Mutoms auf die Tumormikroumgebung ebnet.
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