Auswirkungen einer Photonen-basierten Bestrahlung auf den Verlauf der pH2AX-Foci- Expression, des Zellzyklus und Migrationsverhaltens von Plattenepithelkarzinomzelllinien des Kopf-Hals-Bereichs zu verschiedenen Zeitpunkten nach Strahlenexposition
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Kopf-Hals-Tumore sind eine heterogene Gruppe maligner Neubildungen und gehören weltweit zu den häufigsten Krebserkrankungen. Verschiedene Risikofaktoren begünstigen das Auftreten von Kopf-Hals-Tumoren, wie beispielsweise hoher Alkoholkonsum insbesondere in Kombination mit Tabakrauch aber auch eine Infektion mit humanen Papillomaviren (HPV), insbesondere HPV 16. Bei HPV+ und HPV– Tumoren handelt es sich um zwei eigenständige Krankheitsentitäten, die sich hinsichtlich ihrer Pathogenese, des Therapieansprechens und ihrer Prognose voneinander unterscheiden. Das multimodale Therapiekonzept von Kopf-Hals-Tumoren erfolgt stadienabhängig sowie abhängig von der Tumorlokalisation. Die Behandlung beruht auf den Säulen der operativen Tumorexzision, der Radiotherapie sowie der zytostatischen Chemo- beziehungsweise Immuntherapie. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Untersuchung der Auswirkung ionisierender Strahlung auf HNSCC Tumorzellen unter spezieller Berücksichtigung der Auswirkung auf den Zellzyklus, einschließlich der Expression des Zellzyklus-Inhibitors p21CIP1/WAF1 sowie auf die Zellmigration.
Durch die Bestrahlung kommt es durch die Energieübertragung zu Schädigungen von Molekülen im Gewebe, als wichtigste Zielstruktur lässt sich hierbei die DNA nennen. Hierbei stellen DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) die schwerwiegendsten Schäden dar. Im Rahmen der strahleninduzierten DSB kommt es zu einer posttranslationalen Modifikation von Histonen, wie der Phosphorylierung des Histons H2AX (pH2AX) als eine der ersten Reaktionen. Dieses bindet nun an die DSB und markiert somit den DNA-Schaden der Zelle. Damit geschädigte DNA nicht weiter dupliziert wird, gibt es verschiedene Kontrollsysteme während des Zellzyklus. Die Zellen können je nach Zellzyklusphase in einen p21CIP1/WAF1-abhängigen G1-Arrest bzw. S- oder G2/M-Arrest übergehen, in denen die geschädigte DNA repariert werden kann oder die Zellen in den kontrollierten Zelltod (Apoptose) übergehen. Ziel dieser Arbeit war es, auf zellulärer Ebene die Auswirkung einer Photonen-basierten Bestrahlung auf HPV+ im Vergleich zu HPV– HNSCC zu untersuchen. Insgesamt konnten folgende Beobachtungen gemacht werden:
1. Als eine der ersten Reaktionen kam es bei allen untersuchten Zelllinien zu einem hochsignifikanten Anstieg der pH2AX-Foci mit einer maximalen Ausprägung innerhalb der ersten beiden Stunden. Anschließend kam es durch die Reparatur der DSB zu einem Abfall der Anzahl an Foci. Je höher die Bestrahlungsdosis gewählt wurde, desto höher war die Anzahl der DSB und desto länger persistierte der Strahlenschaden. Bei der HPV+ Zelllinie UPCI-SCC-154 persistierte der Strahlenschaden nach 24 h auf einem höheren Niveau als bei der HPV– UM-SCC-3 oder der Fibroblastenzelllinie L929.
2. Eine bestrahlungsinduzierte höhere und prolongierte pH2AX-Expression korreliert mit einem besseren Therapieansprechen. Im Gegensatz dazu kann eine erhöhte pH2AX-Expression in unbehandelten Zellen auf ein schlechteres Therapieansprechen hindeuten.
3. Bestrahlungsinduziert zeigte sich eine Induktion des Zellzyklusinhibitors p21CIP1/WAF1, welcher im Vergleich zur pH2AX-Expression zeitlich verzögert auftrat. So persistierte 24 h nach der Bestrahlung bei allen untersuchten Bestrahlungsdosen die p21CIP1/WAF1-Expression auf einem höheren Niveau im Vergleich zu den unbestrahlten Zellen. Im Vergleich der einzelnen Zelllinien zeigte sich bei der Fibroblastenzelllinie L929 die stärkste bestrahlungsinduzierte p21CIP1/WAF1-Expression.
4. Im Rahmen der Zellzyklusanalyse zeigten die bestrahlten Zellen innerhalb der ersten 24 h in zunächst einen S-, anschließend G2/M-Arrest, dessen Ausprägung mit der Bestrahlungsdosis korrelierte. Bei den HPV+ Zellen trat der G2M-Arrest später ein als bei den anderen beiden Zelllinien und zeigte eine Persistenz nach 24 h. Bei der HPV– und Fibroblastenzelllinie hatte sich der G2/M-Arrest nach 24 h fast vollständig zurückgebildet. Die Fibroblastenzelllinie ging zusätzlich in einen späten G1-Arrest über.
5. Alle Zelllinien reagierten auf die Bestrahlung mit einer signifikant verzögerten Migrationsleistung, welcher mit der Höhe der Bestrahlungsdosis korrelierte.
Insgesamt konnte in der Arbeit auf zellulärer Ebene das bessere Ansprechen von HPV+ im Vergleich zu HPV¬– HNSCC auf die Bestrahlung bestätigt und das Expressionsverhalten des Zellzyklusinhibitors p21CIP1/WAF1 weiter herausgearbeitet werden. Einschränkend ist zu sagen, dass aufgrund des Umfangs der durchgeführten Untersuchungen insgesamt nur drei Zelllinien mitgeführt werden konnten. Vor diesem Hintergrund können die erhobenen Daten nicht als uneingeschränkt allgemeingültig für HPV+ und HPV– HNSCC gesehen werden. Hierfür sind weitere Analysen an einer größeren Zahl HPV+ und HPV– HNSCC notwendig.
Head and neck squamous cell carcinoma are a heterogeneous group of malignant neoplasms and are among the most common cancers worldwide. There are various risk factors that favor the occurrence of head and neck tumours, such as high alcohol consumation, especially in combination with tobacco smoke, or infection with human papillomaviruses (HPV). HPV+ and HPV– tumours are two distinct disease entities that differ from each other in terms of their pathogenesis, response to therapy and prognosis. The multimodal therapy concept of head and neck tumours depends on the stage and the location of the tumour. Basically, treatment is based on the three pillars of surgical tumour excision, radiotherapy, and cytostatic chemotherapy or immunotherapy using monoclonal antibodies. The focus of the present work was to investigate the effect of ionizing radiation on HNSCC tumor cells with special reference to the effect on the cell cycle, the expression of the cell cycle inhibitors p21CIP1/WAF1 as well as cell migration.
Irradiation causes damage to molecules in the tissue due to the energy transfer; DNA can be named as the most important target structure. DNA double-strand breaks (DSB) represent the most serious damage. In the context of radiation-induced DSB, a post-translational modification of histones occurs, such as phosphorylation of the histone H2AX (pH2AX). This now binds to the DSB and thus marks the DNA damage of the cell. To prevent damaged DNA from being further duplicated, there are various control systems during the cell cycle that are designed to detect damage to the DNA. Depending on the cell cycle phase, the cells can enter a p21CIP1/WAF1-dependent G1 arrest or S or G2/M arrest, in which the damaged DNA can be repaired or the cells can enter controlled cell death (apoptosis).
The aim of this work was to investigate the effect of photon-based irradiation in HPV+ and HPV- HNSCC at the cellular level. Overall, the following observations could be made:
1. As one of the first irradiation responses, there was a highly significant increase in pH2AX foci in all cell lines. The maximum expression of pH2AX foci was reached within the first two hours after irradiation, after which DSB repair occurs with a decrease in the number of foci. The higher the irradiation dose was chosen, the higher the number of DSB and the longer the radiation damage persisted. In addition, the HPV+ UPCI-SCC-154 cell line was found to have radiation damage persisting at a higher level after 24 h than the HPV– cellline UM-SCC-3 or fibroblast cell line L929.
2. Irradiation-induced higher and prolonged pH2AX expression correlates with a better response to therapy. In contrast, increased pH2AX expression in untreated cells may indicate a poorer response to therapy.
3. Irradiation-induced expression of the cell cycle inhibitor p21CIP1/WAF1 occurred with a slight time delay compared to pH2AX expression. Thus, 24 h after irradiation, p21CIP1/WAF1 expression persisted at a higher level compared to the unirradiated cells at all irradiation doses examined. Comparing individual cell lines, the fibroblast cell line showed the strongest irradiation-induced p21CIP1/WAF1 expression.
4. In the cell cycle analysis, the irradiated cells first entered an S- and then a G2/M-arrest within the first 24 h. The severity of the cell cycle arrest correlated with the irradiation dose. The G2M arrest tended to occur somewhat later in the HPV+ cells than in the other two cell lines and was persistent after 24 h and progressive at the higher irradiation doses. In the HPV– UM-SCC-3 and fibroblast cell line L929, the G2/M arrest had almost completely regressed after 24 h. The G2/M arrest in the HPV- cell line UM-SCC-3 was more pronounced than in the HPV+ cell line UPCI-SCC-154. Compared to the HPV+ cell line UPCI-SCC-154, the fibroblast cell line L929 entered a late G1 arrest.
5. All three cell lines responded to irradiation with a significantly delayed migration process, which correlated with the level of irradiation dose.
Overall, the work confirmed at the cellular level the better response of HPV+ compared to HPV– HNSCC cell lines to irradiation and further elaborated the expression behavior of the cell cycle inhibitor p21CIP1/WAF1. As a limitation, due to the extent of the studies performed, a total of only three cell lines could be included. Against this background, the collected data cannot be considered as unrestrictedly general for HPV+ and HPV- HNSCC. For this, further analyses on a larger number of HPV+ and HPV- HNSCC are necessary.
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