Insights into the electron transport proteins essential for nitrogen fixation
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Nitrogen fixation, the process of converting inert gaseous nitrogen (N2) into bioavailable ammonia
(NH3) is essential for all life on earth. Nitrogen is an indispensable element for biology, being an
integral part of amino acids, the building blocks of proteins, and nitrogenous nucleotide bases,
the key components of genetic material. Despite this, nitrogen fixation is a unique feature of only
some microorgansisms called ‘diazotrophs’. Such diazotrophic organisms are vital for the
maintenance of earth’s ecosystems, being the key first step in the global nitrogen cycle.
The enzymes that catalyse this biological nitrogen fixation are the nitrogenases, which are
metalloenzymes harbouring several intricate inorganic cofactors. There are three isoforms of
nitrogenase enyzmes known: the canonical molybdenum (Mo)-nitrogenase and two alternative
nitrogenases, the vanadium (V)-nitrogenase and the iron only (Fe)-nitrogenase. The alternative
nitrogenase isoforms are understudied relative to the Mo-nitrogenase due to their later discovery
and lower catalytic efficiencies for nitrogen fixation. Despite this, the alternative nitrogenases have
important roles under Mo-deplete conditions and show interesting side reactivities with other nonnitrogenous
gases such as carbon dioxide.
Due to their unique activities, nitrogenases have been highly sought-after research targets for
many decades. However, the complex nature of nitrogenases, in terms of their protein structures,
metallocluster structures and their intricate enzymatic maturation, means many unanswered
research questions remain.
One key area of nitrogenase research where knowledge is limited is in the mechanisms of electron
delivery to nitrogenases in vivo. The delivery of high-energy electrons to nitrogenases is essential
for nitrogen fixation, with nitrogenase catalysis requiring both low potential electrons and chemical
energy created by the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP). The low potential electrons
are shuttled to nitrogenases by soluble electron carriers called ferredoxins and flavodoxins.
Despite the importance of these transport mechanisms, only electron transport by ferredoxins and
flavodoxins to the Mo-nitrogenase has been thoroughly characterised. The features and
mechanisms of the electron transport systems to the alternative nitrogenases have not been
thoroughly explored. Prior to this work, it had not been established which soluble electron carriers
shuttle electrons to the Fe-nitrogenase in any organism.
This thesis reports the systematic characterisation of the electron transport systems for nitrogen
fixation by the Fe-nitrogenase, within the photosynthetic diazotrophic bacterium Rhodobacter
capsulatus. Chapter two details the use of microbiological techniques, primarily genetic deletion
Summary
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construction and whole cell proteomics, to identify two distinct essential ferredoxins, FdC and
FdN, for Fe-nitrogenase mediated nitrogen fixation. The two ferredoxins are hypothesised to fulfil
differing roles within the cell, supported by a combination of phylogenetic analysis, plasmid
complementation studies and proteomics experiments. Chapter three builds upon this
hypothesis by uncovering key differences between the structures and electronic properties of FdC
and FdN through biochemical characterisations in vitro. Finally, chapter four describes efforts
towards developing proteomics-based methods for identifying ferredoxin interactions within R.
capsulatus, to map the electron transport pathways occurring during nitrogen fixation.
Overall, this work has created a foundation of knowledge for the future study of ferredoxins
essential for nitrogen fixation. We reveal novel details about the biophysical features of nitrogen
fixation-related ferredoxins, in terms of structure and electronic properties, providing key insights
into how these proteins drive nitrogen fixation. Finally, this work identifies two interesting protein
targets for engineering the electron transport systems to the Fe-nitrogenase in vivo, with aims to
increase electron flux and thus product formation.
Die Stickstofffixierung, der Prozess der Umwandlung von inertem gasförmigem Stickstoff (N 2) in
bioverfügbares Ammoniak (NH3), ist für alles Leben auf der Erde unerlässlich. Stickstoff ist ein
unverzichtbares Element der Biologie, da er ein integraler Bestandteil von Aminosäuren, den
Bausteinen von Proteinen und von stickstoffhaltigen Nukleotidbasen, den Schlüsselkomponenten
des genetischen Materials ist. Trotzdem ist die Stickstofffixierung nur bei einigen
Mikroorganismen, den sogenannten Diazotrophen, ein einzigartiges Merkmal. Diese
diazotrophen Organismen sind für die Erhaltung der Ökosysteme der Erde essenziell, da sie den
ersten Schritt im globalen Stickstoffkreislauf darstellen.
Die Enzyme, die diese biologische Stickstofffixierung katalysieren, werden Nitrogenasen
genannt. Es handelt sich um Metalloenzyme, die mehrere komplexe anorganische Cofaktoren
enthalten. Es sind drei Isoformen von Nitrogenase-Enzymen bekannt: Die kanonische Molybdän
(Mo)-Nitrogenase und zwei alternative Nitrogenasen, die Vanadium (V)-Nitrogenase und die
Eisen (Fe)-Nitrogenase. Die alternativen Nitrogenase-Isoformen sind im Vergleich zur Mo-
Nitrogenase wenig erforscht, da sie erst später entdeckt wurden und eine geringere katalytische
Effizienz bei der Stickstofffixierung aufweisen. Dennoch spielen die alternativen Nitrogenasen
unter Molybdän-limitierenden Bedingungen eine wichtige Rolle und zeigen interessante
Nebenreaktionen mit anderen nicht-stickstoffhaltigen Gasen wie Kohlendioxid.
Aufgrund ihrer einzigartigen Aktivitäten stehen Nitrogenasen seit vielen Jahrzehnten im
Mittelpunkt zahlreicher Forschungsprojekte. Die Komplexität der Nitrogenasen in Bezug auf ihre
Proteinstruktur, ihre Metallcofaktoren und ihre komplizierte enzymatische Maturation bedeutet
jedoch, dass es noch viele offene Forschungsfragen gibt.
Ein Schlüsselbereich der Nitrogenase-Forschung, in dem es noch an Wissen mangelt, sind die
Mechanismen der Elektronenversorgung von Nitrogenasen in vivo. Die Zufuhr von
energiereichen Elektronen zu den Nitrogenasen ist für die Stickstofffixierung unerlässlich, wobei
die Nitrogenasekatalyse sowohl Elektronen mit niedrigem Potenzial, als auch chemische Energie
benötigt, die durch die Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) erzeugt wird. Die Elektronen
mit niedrigem Potenzial werden durch lösliche Elektronenträger, die Ferredoxine und
Flavodoxine, zu den Nitrogenasen transportiert. Trotz der Bedeutung dieser
Transportmechanismen ist nur der Elektronentransport durch Ferredoxine und Flavodoxine zur
Mo-Nitrogenase gründlich charakterisiert worden. Die Eigenschaften und Mechanismen der
Elektronentransportsysteme zu den alternativen Nitrogenasen sind noch nicht eingehend
Zusammenfassung
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erforscht worden. Vor dieser Arbeit war nicht bekannt, welche löslichen Elektronenträger im
Organismus Elektronen zur Fe-Nitrogenase transportieren.
In dieser Arbeit wird die systematische Charakterisierung des Elektronentransportsystems für die
Stickstofffixierung durch die Fe-Nitrogenase im photosynthetischen diazotrophen Bakterium
Rhodobacter capsulatus beschrieben. Kapitel zwei beschreibt mikrobiologische Techniken, vor
allem die Ausführung von Gendeletionen und Ganzzellproteomik, um zwei essenzielle
Ferredoxine, FdC und FdN, für die durch Fe-Nitrogenase vermittelte Stickstofffixierung zu
identifizieren. Die Hypothese, dass die beiden Ferredoxine unterschiedliche Aufgaben innerhalb
der Zelle erfüllen, wird durch eine Kombination aus phylogenetischer Analyse,
Plasmidkomplementationsstudien und Proteomikexperimenten gestützt. Kapitel drei baut auf
dieser Hypothese auf, indem es die wesentlichen Unterschiede zwischen den Strukturen und
elektronischen Eigenschaften von FdC und FdN durch biochemische Charakterisierungen in vitro
aufdeckt. Schließlich werden in Kapitel vier die Bemühungen um die Entwicklung
proteomikbasierter Methoden zur Identifizierung von Ferredoxin-Interaktionen in R. capsulatus
beschrieben, um die Elektronentransportwege während der Stickstofffixierung zu kartieren.
Insgesamt hat diese Arbeit eine Wissensgrundlage für die künftige Untersuchung von
Ferredoxinen geschaffen, die für die Stickstofffixierung wichtig sind. Wir enthüllen neue Details
über die biophysikalischen Merkmale von Ferredoxinen, die mit der Stickstofffixierung in
Verbindung stehen, in Bezug auf Struktur und elektronische Eigenschaften, die wichtige
Erkenntnisse darüber liefern, wie diese Proteine die Stickstofffixierung vorantreiben. Schließlich
identifiziert diese Arbeit zwei interessante Zielproteine für das Engineering der
Elektronentransportsysteme der Fe-Nitrogenase in vivo mit dem Ziel, den Elektronenfluss und
damit die Produktbildung zu erhöhen.
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