Untersuchungen zur Cimicifugasäure- und Fukinolsäurebiosynthese in Actaea racemosa und Petasites japonicus
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Bezüglich der Cimicifugasäure- und Fukinolsäurebiosynthese gibt es nach
aktuellem Forschungsstand erste Einblicke. Es wurde kürzlich ein Enzym aus
Actaea racemosa isoliert und charakterisiert, welches die Fähigkeit besitzt
verschiedene Cimicifugasäuren aus Piscidinsäure und verschiedenen
Hydroxyzimtsäure-CoA-Thioestern als Substraten zu katalysieren
(Cimicifugasäure-Synthase). Im Hinblick auf die Fukinsäure- bzw.
Fukinolsäurebiosynthese verbleiben jedoch offene Fragen bezüglich der
Ursprünge der Hydroxygruppe in Kombination mit einer Kohlenstoff-Einheit in
Piscidin- bzw. Fukinsäure.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Cimicifugasäure- und
Fukinolsäurebiosynthese in Actaea racemosa und Petasites japonicus
durchgeführt. Es gelang die Isolierung und Charakterisierung einer
Hydroxy(phenyl)pyruvat Reduktase (H(P)PR) aus A. racemosa (ArH(P)PR). Die
Bestimmung der kinetischen Parameter ergab, dass NADPH das bevorzugte
Co-Substrat und β-Hydroxypyruvat das präferierte Substrat darstellen. Dem
Enzym kann somit sowohl eine HPPR, als auch eine Hydroxypyruvat Reduktase-
Aktivität zugeschrieben werden. Expressionsanalysen der ArH(P)PR ergaben,
dass dieses Enzym in den oberirdischen Pflanzenorganen zu finden ist.
Die ArH(P)PR könnte, zusammen mit der Tyrosin Aminotransferase (TAT), eine
wichtige Rolle bei der Biogenese der Fukinolsäure und der Cimcifugasäuren
spielen. Für nähere Analysen zu dieser Hypothese wurde in dieser Arbeit
zusätzlich die TAT aus A. racemosa (ArTAT) charakterisiert. Für die Substrate
2-Oxoglutarat und L-Tyrosin konnten die kinetischen Parameter bestimmt
werden. Weiterhin konnte bestätigt werden, dass die ArTAT Prephenat, Pyruvat
und Oxalacetat umsetzt.
Daneben wurden weitere Untersuchungen bezüglich der gebildeten
Fukinolsäuremengen in in vitro-Kulturen in unterschiedlichen Nährmedien, durch
Elicitierung und im zeitlichen Verlauf durchgeführt. Hierbei zeichnete sich deutlich
ab, dass die Fukinolsäuremenge aus frischem Blattmaterial (A. racemosa,
P. japonicus) im Vergleich zu den Zellkulturen stets größer war. Weiterhin
erbrachte die Elicitierung mit Suberoylhydroxamsäure (in DMSO), einem Histon
Deacetylase-Hemmstoff, selbst keinen Einfluss auf die Fukinolsäuremenge in
A. racemosa, jedoch ließ die Behandlung nur mit dem Lösungsmittel die
Fukinolsäurebildung zunehmen.
Current research has provided initial insights into the biosynthesis of cimicifugic
acid and fukinolic acid. An enzyme from Actaea racemosa (cimicifugic acid
synthase) has been isolated and characterized recently. This enzyme has the
ability to catalyze the formation of various cimicifugic acids using piscidic acid
and various hydroxycinnamic acid CoA-esters as substrates. On the other hand,
with regard to fukiic and fukinolic acid biosynthesis, the origins of the hydroxyl
group connected to a carbon moiety in piscidic and fukiic acid remains unclear.
In this work, studies on cimicifugic acid and fukinolic acid biosynthesis in
A. racemosa and Petasites japonicus have been performed. The isolation and
characterization of a hydroxy(phenyl)pyruvate reductase (H(P)PR) from
A. racemosa (ArH(P)PR) was successful. The determination of the kinetic
parameters revealed that NADPH is the preferred co-substrate and
β-hydroxypyruvate is the preferred substrate. Thus, both, HPPR and
hydroxypyruvate reductase activities can be attributed to the enzyme. Expression
analyses of ArH(P)PR showed the presence of this enzyme in flower, flower stalk,
leaf and stem plant material, while it could not be detected in roots.
ArH(P)PR, together with tyrosine aminotransferase (TAT), could play an
important role in the biogenesis of fukinolic acid and cimicifugic acids. For further
analysis of this hypothesis, TAT from A. racemosa (ArTAT) was additionally
characterized in this work. The kinetic parameters for the substrates
2-oxoglutarate and L-tyrosine could be determined. Furthermore, it was
confirmed that ArTAT converts prephenate, pyruvate and oxaloacetate.
In addition, further studies were carried out on the amounts of fukinolic acid
formed in in vitro cultures in different culture media, by elicitation and over time.
This clearly showed that the amount of fukinolic acid from fresh leaf material
(A. racemosa, P. japonicus) was always higher compared to the amount in cell
cultures. Furthermore, elicitation with suberoylhydroxamic acid (in DMSO), an
inhibitor of histone deacetylase, had no effect on the amount of fukinolic acid in
A. racemosa, but treatment with the solvent increased the formation of fukinolic
acid.
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