Charakterisierung der luminalen Kompartimentierung von Peroxisomen und ihrer Rolle bei der Entstehung peroxisomaler Subpopulation
Abstract
Peroxisomen sind hochkonservierte eukaryotische Organellen mit wesentlichen Funktionen beim oxidativen Abbau von Fettsäuren und der Entgiftung von Wasserstoffperoxid. Darüber hinaus haben Peroxisomen diverse andere metabolische Funktionen, die auch hochspezifisch für eine Gruppe von Organismen sein können, z.B. werden Sekundärmetaboliten wie Penicillin in den Peroxisomen mancher Pilze hergestellt. Es ist weitgehend unerforscht, wie in den Peroxisomen diverse sehr unterschiedlich Stoffwechselwege miteinander koexistieren können. Es handelt sich ultrastrukturell um simple von einer einfachen Membran umschlossenen Vesikel. Schon lange weiß man aber, dass manche Enzyme in stabilen Kernstrukturen vorliegen, die resistent gegenüber Detergenzien sind. Zum Beispiel liegt die Urat-Oxidase, für den oxidativen Abbau von Harnsäure verantwortlich, in den Peroxisomen mancher Säugetiere als kristalliner Kern im Lumen der Organellen vor. In dem Brandpilz Ustilago maydis war bei der Analyse der Biosynthese von extrazellulären Glykolipiden aufgefallen, dass die zwei peroxisomalen Acyltransferasen Mac1 und Mac3 nicht gleichmäßig über alle Peroxisomen verteilt sind, sondern nur in einer Subpopulation vorliegen. Die genauere Charakterisierung dieses Phänomens war das Ziel dieser Arbeit. Es zeigte sich, dass nach Induktion der Peroxisomen-Proliferation durch Zugabe einer langkettigen Fettsäure (Ölsäure) die ungleichmäßige Lokalisation zunahm. Es können sich demnach unter veränderten Wachstumsbedingungen unterschiedliche Populationen von Peroxisomen bilden. Mit Hilfe von hochauflösender Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Mac1 und Mac3 an der Peripherie der Peroxisomen lokalisieren und stabile Subdomänen bilden, die nicht über das gesamte Lumen verteilt sind. Weitere Analysen führten zur Identifizierung eines kurzen Peptidmotiv mit der Aminosäuresequenz TIIV in Mac3, welches für die Akkumulation von Mac3 in peroxisomalen Subdomänen sowohl notwendig als auch ausreichend ist. Bei den Subdomänen handelte es sich vergleichbar mit der Urat-Oxidase aus Säugern um gegenüber Detergens resistenten Strukturen. Weitere Experimente zeigten, dass auch die Urat-Oxidase (Uox1) aus U. maydis ebenfalls in den Kernstrukturen vorliegt in denen auch die Mac Enzyme zu finden sind. Bei der Bildung dieser Strukturen handelt es demnach um ein vermutlich konserviertes Phänomen.
Ferner konnte gezeigt werden, dass die Bildung der Kernstrukturen der metabolischen Kompartimentierung der Peroxisomen dient. Varianten von Mac3 und Uox1, die nicht mehr in den Kernstrukturen lokalisieren können, behindern Wachstum und Metabolismus, wenn die Zellen nur über Ölsäure als Kohlenstoffquelle verfügen. Bisher untersuchte Enzyme die für die -Oxidation von Fettsäuren verantwortlich sind, akkumulieren nicht in den Kernen. Daraus
ergab sich die folgende Hypothese: Das peroxisomale Lumen ist unterteilt in eine -Oxidation-Zone und weitere Zonen. In den weiteren Zonen (Kernen) sind Enzyme für speziellere biochemische Aufgaben der Peroxisomen lokalisiert. Tatsächlich, konnte eine Reihe von weiteren peroxisomalen Enzymen in U. maydis identifiziert werden, die in Subdomänen lokalisiert sind und auch eher spezielle Funktionen erfüllen. Dazu zählen die D-Aminosäure-Oxidase (Dao1) und ein Enzym mit einer potentiellen Rolle für den Abbau von Xenobiotika. Die in U. maydis erarbeiteten Regeln sind vermutlich auch in Säugerzellen gültig. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die metabolische Vielfältigkeit der Peroxisomen durch die Bildung von Kernstrukturen ermöglicht wird.
Peroxisomes are highly conserved eukaryotic organelles with essential functions in the
oxidative degradation of fatty acids and the detoxification of hydrogen peroxide. Peroxisomes
fulfill various other metabolic functions that can be highly specific to a group of organisms; for
example, secondary metabolites such as penicillin are produced in the peroxisomes of certain
fungi. It is largely unexplored how diverse and very different metabolic pathways can coexist
within peroxisomes. They appear as ultrastructurally simple vesicles enclosed by a single
membrane. However, it has long been known that some peroxisomal enzymes exist in stable
core structures that are even resistant to treatment with detergent. For instance, urate oxidase,
which is involved in the oxidative degradation of uric acid, is present as a crystalline core in
the lumen of mammalian peroxisomes.
In the smut fungus Ustilago maydis, studies on the biosynthesis of extracellular glycolipids
revealed that the two peroxisomal acyltransferases, Mac1 and Mac3, are not evenly distributed
across all peroxisomes but are found only in a subpopulation. The precise characterization of
this phenomenon was the aim of my thesis. After induction of peroxisome proliferation by the
addition of a long-chain fatty acid (oleic acid), the irregular localization pattern increased.
Using high-resolution microscopy, we could show that Mac1 and Mac3 localize at the periphery
of the peroxisomes and form stable subdomains. Further analysis led to the identification of a
short peptide motif with the amino acid sequence TIIV in Mac3. Presence of this sequence is
necessary and sufficient for the accumulation of Mac3 in peroxisomal subdomains and
subpopulations. Purification of organelles demonstrate that these subdomains are detergent-
resistant structures similar to urate oxidase from mammals. Interestingly, Urate oxidase (Uox1)
from U. maydis is also present in detergent-resistant condensates. Hence, the formation of these
structures appears to be a conserved phenomenon. Furthermore, we found that the formation of
core structures enables metabolic compartmentalization of peroxisomes. Variants of Mac3 and
Uox1 that can no longer localize in cores affect cell growth and metabolism when the cells rely
solely on oleic acid as a carbon source. Moreover, several enzymes responsible for β-oxidation
of fatty acids do not accumulate in cores. This led to the following working model: the
peroxisomal lumen is divided into a β-oxidation compartment and other regions. In the other
regions (cores), enzymes for more specialized biochemical tasks of the peroxisomes are
localized. Indeed, a number of other peroxisomal enzymes in U. maydis that are localized in
subdomains fulfill more specialized functions. These include D-amino acid oxidase (Dao1) and
an enzyme with a potential role in the degradation of xenobiotics. Further investigations
Zusammenfassung | IV
indicated that the rules developed in U. maydis are also applicable to mammalian cells. In
summary, the research underlying my thesis shows that the metabolic diversity of peroxisomes
is supported by the formation of stable core structures
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