Von peptidischen zu nicht-peptidischen Hemmstoffen der Proproteinconvertase Furin
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Die Proproteinconvertase Furin ist durch Prozessierung von endogenen Vorläuferproteinen an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen im Körper beteiligt und kommt in nahezu jedem Gewebe vor. Furin ist durch seine vielfältigen Substrate mit zahlreichen endogenen pathophysiologischen Prozessen sowie viralen und bakteriellen Infektionen assoziiert. Die Hemmung des Furins könnte für diese Erkrankungen eine mögliche Therapieoption darstellen.
Bisher entwickelte peptidische Furinhemmstoffe wie der Inhibitor 9 (MI-1148) sind hochaffin, zeigen jedoch aufgrund ihres stark basischen Charakters toxische Eigenschaften in der Maus. Durch den Austausch des Arg durch Cav in P4- und P2 Position konnte die Basizität der Hemmstoffe und damit ihre Toxizität bereits deutlich reduziert werden. Bisher ist es jedoch noch nicht gelungen, das in P1 Position befindliche Benzamidin-Derivat Amba 26 (Abbildung 6) durch weniger basische Strukturen unter Erhalt der Furinhemmung in vitro und antiviralen Wirkung in Zellkultur zu ersetzen. In einem von Dr. DAHMS in der AG KLEBE durchgeführten kristallographischen Screening wurde das Fragment 1H Isoindol-3-amin (25a) als mögliches Substitut für das basische Amba (26) identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das für den Einbau in Inhibitoren modifizierte Derivat Amia (27) hergestellt (Abbildung 22). Dabei wurden zwei Synthesewege beschritten. Der erste Syntheseweg erwies sich für die Darstellung von Amia (27) als wenig effizient, da im letzten Schritt nur durch wiederholte Zugabe von Edukten, wie dem toxischen NaCN, eine geringe Menge Produkt gewonnen werden konnte. In einem zweiten Syntheseweg konnte die Ausgangsverbindung 2,4 Dimethylbenzonitril (33) in einer dreistufigen Synthese zu Amia (27) reproduzierbar umgesetzt werden. Das Amia (27) wurde an P5 – P2-Segmente bekannter peptidischer Amba-Derivate gekuppelt, um die Amia-Analoga 39 – 41 zu erhalten. Die enzymkinetische Charakterisierung zeigte eine starke Hemmung des Furins durch die Amia Verbindungen, die leicht verbesserte Ki Werte im Vergleich zu den Amba Derivaten besitzen. In weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, dass die verwandte Proproteinconvertase PC7 von den Amia-Derivaten im zweistellig nanomolaren Bereich gehemmt wird. Die höchste Selektivität für Furin zeigt der Inhibitor 41, der Furin ca. 7400-fach stärker hemmt. Die Amia-Verbindungen wurden zusätzlich in Zellkultur durch KONSTANTIN BLOCH in der AG FRIEBERTSHÄUSER auf ihre antivirale Wirksamkeit untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass einige Amia Verbindungen sowohl gegen das vor allem für Kleinkinder gefährliche RSV als auch gegen das hochpathogene Influenzavirus SC35M stärker antiviral wirksam als die Amba Referenzverbindung 10 (MI-1851) sind. Für Verbindung 41 konnte in der Maus eine zum Amba-Analogon 10 vergleichbar geringe Toxizität gezeigt werden (Toxizitätsstudie durchgeführt von PHARMACOLOGY DISCOVERY SERVICES TAIWAN, LTD.).
Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass peptidische Inhibitoren mit einem 4 AMe-Phac als P5-Rest im Vergleich zu Inhibitoren mit einer 4 GMe Phac Gruppe weniger toxisch sind, aber auch eine schwächere Hemmung des Furins bewirken. Durch die Verlängerung der Alkylkette des 4 AMe Phac-Restes um zwei Kohlenstoffe sollte die Affinität der Inhibitoren bei gleichbleibender Toxizität verbessert werden. Dazu wurde 4 (Aminopropyl) phenylessigsäure 44 synthetisiert und in den Inhibitor 50 eingebaut. Das als Nebenprodukt erhaltene hydroxylierte Derivat 4 (3 Amino 1 hydroxypropyl) Phenylessigsäure 48 wurde zur Synthese des Inhibitors 51 verwendet. Da beide Verbindungen nicht zu einer stärkeren Furinhemmung führten, wurde diese Strategie nicht weiter verfolgt.
Guanylhydrazon-Derivate sind relativ schwach basische Verbindungen, die Furin mit Ki Werten im mikromolaren Bereich hemmen. Durch die Synthese der Verbindungen 72 und 73 konnten Oxyguanidin-Analoga der Guanylhydrazone 14 und 15 dargestellt werden. In den von Dr. DAHMS bereitgestellten Kristallstrukturen der Verbindungen 72 und 73 konnte ein leicht abweichender Bindungsmodus des Oxyguanidins 72 im Vergleich zum Guanylhydrazon 14 gezeigt werden. In enzymkinetischen Untersuchungen, bei denen das Oxyguanidin 72 in einer Konzentration von 100 µM eingesetzt wurde, konnte eine Restaktivität des Furins von 53 % festgestellt werden. Demzufolge ist die Verbindung 72 ein deutlich schwächerer Furinhemmstoff als das Guanylhydrazon 14. Die Kristallstrukturen der Verbindungen 72 und 73 tragen dennoch zum Verständnis der Bindungseigenschaften von Inhibitoren mit diesen schwach basischen Gruppen an Furin bei.
Cav-Rink-Amid-Derivate sind ein neuartiger Hemmstofftyp. Die von Dr. LAM VAN zuerst synthetisierten diastereomeren Verbindungen 52 und 53 waren die ersten Verbindungen dieses Strukturtyps. Für beide Verbindungen konnten von Dr. DAHMS die Kristallstrukturen im Komplex mit Furin bestimmt und dadurch die jeweilige Konfiguration ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige verlängerte Derivate dieses Hemmstofftyps synthetisiert. Die Furinhemmung konnte lediglich durch Bestimmung der IC50 Werte evaluiert werden. Die am stärksten hemmenden Diastereomere 58 und 59 besitzen mit ca. 100 µM einen ca. 7-fach besseren IC50 Wert als die Ausgangsverbindungen. Aufgrund der geringen Ausbeuten und ihrer moderaten Hemmwirkung scheint eine Weiterverfolgung dieser Inhibitoren zum jetzigen Zeitpunkt nicht sinnvoll.
Die neuartigen BOS-Inhibitoren sind ursprünglich von der Firma GSK patentierte nicht-peptidische Furininhibitoren mit einem 3,5 Dichlorbiphenyl- bzw. 3,5 Dichlorphenylpyridinyl-Fragment, die in eine durch Konformationsänderung des Trp254 freigelegte kryptische Bindetasche des Furins binden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine einfache Synthesestrategie zur Herstellung ähnlicher, jedoch nicht unter den Patentschutz fallender Verbindungen mit symmetrischem 3,5 Dichlorbiphenyl Fragment entworfen, mit der unsymmetrische und symmetrische Derivate synthetisiert wurden. Hergestellte Amid-Derivate wie Verbindung 80 zeigten fast keine Furinhemmung. Durch Reduktion konnten die doppelt und einfach reduzierten Analoga der Verbindung 80 gewonnen werden, die Furin im dreistellig nanomolaren Bereich hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Interaktion eines basischen Amins mit Glu236 und Tyr308 essentiell für die Affinität dieses Inhibitortyps ist. Weitere symmetrische und unsymmetrische Derivate wurden über einen alternativen Syntheseweg hergestellt, bei dem das zentrale Dibromid Derivat 88 zur Alkylierung von Aminen benutzt wurde. Der Inhibitor 103 zeigte dabei die stärkste Furinhemmung. Durch Modifizierung wurden die verlängerten Derivate 112 – 118 hergestellt. Bis auf die Verbindung 117, erwiesen sich diese Inhibitoren als noch stärker wirksam als die Verbindung 103. Für die Verbindungen 104 und 105 konnten aufgrund eines abweichenden Hemmmechanismus lediglich IC50 Werte ermittelt werden. Von Dr. DAHMS bestimmte Kristallstrukturen der Inhibitoren im Komplex mit Furin belegen, dass die in dieser Arbeit hergestellten Derivate analog zu den BOS Inhibitoren die kryptische Bindetasche adressieren. Enzymkinetische Messungen ausgewählter Verbindungen mit PC7 zeigen eine starke Hemmwirkung der Verbindung 105, wodurch diese als Ausgangssubstanz für selektive PC7-Inhibitoren dienen könnte. Durch KONSTANTIN BLOCH konnte eine signifikant dosisabhängige antivirale Wirksamkeit für den Inhibitor 103 in Zellkultur gezeigt werden, wohingegen die Derivate 109 und 118 sich als deutlich weniger wirksam erwiesen. Die neuartige Grundstruktur der synthetisierten Inhibitoren könnte ein geeigneter Ausgangspunkt für die Entwicklung weiter optimierter Furinhemmstoffe mit verbesserter Wirksamkeit sowohl in vitro als auch bezüglich ihrer antiviralen Aktivität in vivo sein.
The ubiquitously expressed proprotein convertase furin cleaves precursor proteins in a plethora of physiological processes. It is associated with endogenous pathophysiological events and infectious diseases. The inhibition of furin is a potential option for treating these diseases.
To date, peptidic furin inhibitors like compound 9 (MI-1148) are highly active against furin but possess toxic side effects due to their strong basic characteristics. Recent studies yielded the less toxic compound 10 (MI-1851). Still, all these highly active peptidic compounds contain a strong basic amba (26) residue in the P1 position. Starting from a crystallographic screening approach by Dr. DAHMS, 1H Isoindol 3 amine (25a) was deemed a promising structure for a less basic P1 residue. In this dissertation, amia (27) was designed as a couplable derivative of compound 25a, for which two synthetic approaches are described. Amia was incorporated in the peptidic P5 – P2 segments of known amba derivatives to yield the corresponding amia analogs. Enzyme kinetic measurements showed slightly improved picomolar Ki values for the amia-containing inhibitors with furin compared to their amba analogues and a double-digit nanomolar inhibition constant for PC7, indicating a high selectivity for furin. The antiviral activity for the amia compounds was determined in cell culture by KONSTANTIN BLOCH (FRIEBERTSHÄUSER group), showing that all tested amia compounds are active against RSV and SC35M, respectively. In fact, the antiviral efficacy of some amia compounds was stronger than for the used amba reference inhibitor 10. As for the amba compound 10 the toxicity for the amia analog 41 was evaluated in mice. The results show comparable toxicity for these two compounds.
The 4 GMe Phac as P5 residue of peptidic compounds improves the furin inhibition, but results in a stronger toxicity compared to their 4 AMe Phac analogues. The extension of the 4 AMe Phac alkyl chain by two carbons was intended to combine the less toxic characteristics of 4-AMe-Phac with the affinity of the 4 GMe Phac. Hence, the 2-(4-(3-aminopropyl)phenyl)acetic acid (44) was synthesized and incorporated in inhibitor 50. During the synthesis of compound 44, a side product was formed and analyzed, revealing the hydroxylated structure 48, which was then incorporated into inhibitor 51. Unfortunately, no improvement in inhibitory potencies was found for both inhibitors 50 and 51 compared to the 4 AMe Phac analogue.
Guanylhydrazone derivatives are weakly basic furin inhibitors. By synthesis of compounds 72 and 73 the oxyguanidine analogues of the guanylhydrazones 14 and 15 were obtained. The obtained crystal structures in complex with furin show slightly deviating binding modes for compound 72 compared to its guanylhydrazone analog 14. In enzyme kinetic measurements with 100 µM of compound 72, furin shows a residual activity of 53 %. Therefore, compound 72 is significantly less active against furin than its guanylhydrazone analogue 14.
The diastereomeric Cav-Rink-amide-derivatives 52 and 53, originally synthesized by Dr. LAM VAN, are a new type of furin inhibitors. The obtained crystal structures of these compounds inspired to synthesize elongated derivatives. For the diastereomeric compounds 58 and 59, a sevenfold decreased IC50 value to approximately 100 µM could be determined. Nevertheless, it does not seem reasonable to pursue this approach further.
The so-called BOS-inhibitors are non-peptidic furin inhibitors, which were first patented by GSK. These compounds contain a 3,5 Dichlorobiphenyl- or 3,5 Dichlorophenylpyridinyl fragment, which binds in a so far unknown cryptic binding pocket. In this dissertation, a simple synthesis strategy was implemented for the development of several symmetric and asymmetric compounds, which are not protected by the original patent. The interaction of a basic nitrogen with Glu236 and Tyr308 was found in previously published crystal structures and could herein be confirmed as a key parameter for the binding to furin. The inhibitor 103 showed high antiviral activity and efficacy against furin in enzyme kinetic measurements and was further modified to obtain compounds with better Ki values. For the two tested modified derivatives a reduced antiviral activity was found. Selected compounds were also tested with PC7 in enzyme kinetic measurements. Surprisingly, the compound 105 was found to have the best efficacy against PC7 while showing an unknown inhibition mode for furin. The determined crystal structures reveal a similar binding mode of the newly synthesized compounds compared to the BOS-inhibitors.