Darstellung und funktionelle Analyse von extrazellulären Vesikeln im Kontext epithelialer Aktivierungsprozesse bei Asthma bronchiale
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Die zentrale Fragestellung der vorliegenden Arbeit bestand darin zu untersuchen, ob von Zellen sezernierte extrazelluläre Vesikel (EVs) eine Funktion in der interzellulären Kommunikation übernehmen und so zur Entstehung und Ausbreitung entzündlicher Prozesse in den Atemwegen bei Asthma bronchiale beitragen. Die Untersuchungen wurden in vitro mittels Zellen der humanen bronchialen Epithelzelllinie BEAS-2B durchgeführt. Es wurden EV-Proben verwendet, die aus Überständen von Air-liquid-interface-Kulturen primärer, bronchialer Epithelzellen von gesunden bzw. asthmatischen Spendern gewonnen wurden. Zur Isolation der EVs wurde eine Kombination aus Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie eingesetzt. Aus den Ergebnissen von Voruntersuchungen ging hervor, dass diese Methode gut geeignet ist, um EVs aus einer Probe zu konzentrieren und dabei ihre morphologischen sowie funktionellen Eigenschaften zu erhalten.
Im Rahmen der Arbeit sollte zunächst die Hypothese überprüft werden, dass EVs durch epitheliale Empfängerzellen aufgenommen werden. Hierzu wurden EVs durch verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe markiert. Von den getesteten Farbstoffen stellte sich die Anfärbung mit Carboxyfluorescein-Succinimidyl-Ester (CFSE) als die beste Variante der Fluoreszenzmarkierung für apikal und basal freigesetzte EVs von primären humanen bronchialen Epithelzellen heraus. Im Folgenden wurde die Aufnahme von CFSE-markierten apikalen EVs durch Empfängerzellen konfokalmikroskopisch analysiert. Dabei zeigte sich, dass diese EVs nach sechs Stunden zwar an Zellen gebunden vorlagen, sie schienen jedoch nicht durch Empfängerzellen aufgenommen worden zu sein.
Des Weiteren wurde die Hypothese getestet, dass apikale EVs, die von Zellen asthmatischer Spender stammen, im Gegensatz zu EVs gesunder Donoren eine proinflammatorische Reaktion in gesunden Empfängerzellen auslösen. Hierzu wurden BEAS-2B Zellen für 24 Stunden durch EVs aus bronchialen Epithelzellen gesunder beziehungsweise asthmatischer Spender stimuliert. Die Reaktion der Zellen wurde durch quantitative-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-qPCR) zum Nachweis der Expression verschiedener Gene, Enzym-gekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA) für Interleukin 8 und indirekte Stickstoffmonoxid-Quantifizierung nach Griess analysiert. Dabei wurden die Ergebnisse nach Stimulation durch EVs jeweils den Ergebnissen einer unstimulierten Negativkontrolle und einer durch Lipopolysaccharid stimulierten Probe gegenübergestellt. Für alle ausgewählten Gene der Tight-Junction-Proteine zeigten sich gegenüber der Negativkontrolle signifikant verminderte Expressionslevel nach Stimulation durch EVs asthmatischer Spender. Dies kann als Ausdruck einer gestörten Barrierefunktion und einer erhöhten Durchlässigkeit des Epithels im Rahmen einer asthmatischen Atemwegsentzündung gedeutet werden. Für die ausgewählten epithelialen Entzündungsmarker sowie das PYD- und CARD-Domäne-enthaltende-Gen wurden verminderte oder unveränderte Expressionslevel nach Stimulation durch EVs asthmatischen Ursprungs beobachtet. Im Gegensatz zu EVs von Asthma-Patienten konnten EVs gesunder Spender für keines der ausgewählten Gene eine signifikante Änderung der Genexpression auslösen. Allein die Translation von Interleukin 8 war auch nach Stimulation durch EVs gesunder Spender vermindert.
Zusammenfassend weisen die erhaltenen Ergebnisse auf eine mögliche Beteiligung von EVs an der interzellulären Signalübermittlung bei Asthma hin. Sie scheinen zur Entstehung und Ausbreitung einer asthmatischen Entzündungsreaktion beizutragen. Somit könnte ihre weitere funktionelle Analyse ein bedeutender Aspekt sein, um ein tieferes Verständnis zugrundeliegender Pathomechanismen von Asthma bronchiale zu erlangen. Perspektivisch könnte es aufgrund der Heterogenität von Pathomechanismen von Asthma bronchiale sinnvoll sein, Endotypen von asthmatischen Spendern spezifisch zu analysieren, um Ergebnisse funktioneller Untersuchungen von EVs besser einordnen zu können. Weitere Untersuchungen anhand anderer experimenteller Systeme und ggf. auch anhand anderer Empfängerzellen sind notwendig, um die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse zu prüfen. Außerdem sollten neben EVs auch die zugehörigen EV-freien Proben im Hinblick auf eine Aktivierung von Zielzellen analysiert werden. Möglicherweise könnte eine synergistische Kombination von EVs und löslichen Bestandteilen wie Proteinen in den Überständen der Epithelzellkulturen erforderlich sein, um das volle Potential der Signalübermittlung durch EVs auszuschöpfen.
Die Analyse der Funktionen von EVs für pathologische Prozesse bei Asthma bronchiale birgt großes Potential zugrundeliegende Pathomechanismen zu verstehen und beitragende Akteure des Entzündungsgeschehens zu identifizieren. Sollten sich EVs als wichtige Faktoren der Signalübermittlung bei Asthma erweisen, könnte eine Hemmung entsprechender Funktionen als innovativer Ansatz zur Entwicklung individualisierter Therapiekonzepte dienen. Daneben könnten EVs in Zukunft auch in der Diagnostik zur Identifikation von Asthma-Endotypen von Bedeutung sein, da sie in Abhängigkeit des Zustandes ihrer Ursprungszelle verschiedene Signalmoleküle transportieren. Darüber hinaus stellen EVs einen vielversprechenden Ansatz zur zielgerichteten Verteilung von Medikamenten dar. Sicherlich werden weitere methodische Verbesserungen entscheidend dazu beitragen das noch junge Forschungsfeld der EVs weiterhin und tiefergehender zu explorieren.
The major aim of the present study referred to the question, whether extracellular vesicles
(EVs), that are released by cells, play a role in intercellular communication mechanisms and
thereby contribute to the emergence and propagation of inflammatory processes in the airways
during asthma. The respective analyses were conducted in vitro using cells of the human
bronchial epithelial cell line BEAS-2B. EVs were obtained from cell culture supernatant of
healthy and asthmatic primary bronchial epithelial cells cultured under air-liquid-interface
conditions. EVs were concentrated by a combination of ultrafiltration and size exclusion
chromatography. The results of preliminary experiments suggested that this method was well
suited to concentrate EVs in a sample without compromising their morphological and functional
properties.
Within the scope of this study, initially the hypothesis should be examined, that EVs are taken
up by recipient epithelial cells. Therefore, EVs were labelled by different fluorescence dyes. Of
the tested dyes carboxyfluorescein-succinimidyl-ester (CFSE) proved to be the most promising
labeling approach for extracellular vesicles originating from the apical and basal compartment
of primary bronchial epithelial cells. Thereafter the uptake of CFSE-labelled apical EVs was
investigated by confocal microscopy. It was shown that EVs seemed to become attached to
the cell surface rather than having been incorporated by recipient cells after six hours of
incubation time.
The second hypothesis to be tested in this study implied, that apical EVs from asthmatic cells
in contrast to EVs from healthy cells induce an inflammatory response in healthy recipient cells.
For this purpose, BEAS-2B cells were incubated with EVs of healthy or asthmatic origin for 24
hours. The extend of a potential inflammatory response of the recipient cells was examined by
real-time-quantitative-polymerase-chain-reaction (RT-qPCR) to detect the expression of a
variety of related genes, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Interleukin 8 and
by indirect quantification of nitric oxide according to Griess. In each case the results after
stimulation by EVs were compared to unstimulated negative and lipopolysaccharide-
stimulated positive control samples. For all selected genes of tight-junction-proteins a
significant decrease of expression as compared to the negative control was detected after
stimulation by EVs from asthmatic patients. This might hint to an impaired barrier function and
an increased epithelial permeability during asthmatic airway inflammation. For the selected
epithelial inflammatory markers as for the PYD and CARD domain containing gene a
decreased or unaltered expression was detected after stimulation by EVs of asthmatic origin.
In contrast to EVs from asthmatic patients EVs form healthy donors did not cause a significant
change in the expression of any of the selected genes. Only the translation of Interleukin 8
was decreased after stimulation by EVs from healthy donors.
In summary, the results suggest a potential role of EVs in intercellular signaling processes in
asthma. They seem to contribute to emergence and propagation of asthmatic inflammatory
processes. Hence further examination of extracellular vesicle function might substantially add
to our understanding of underlying pathomechanisms of asthma. Prospectively it might be
helpful to specifically analyze EVs from asthmatic patients affected by different endotypes of
the disease to evaluate results on a more substantiated basis as heterogenic and multiple
pathomechanisms possibly induce different forms of inflammatory responses. Further
experiments with other experimental systems and perhaps other recipient cells are necessary
to verify the reproducibility of obtained results suggesting a signal transmitting function of EVs
in asthma. Furthermore, associated non-EV samples should be analyzed in parallel to identify
their functional contribution to signal transmission processes. Conceivably a synergistic
interaction of EVs and soluble components like proteins might be crucial to exploit the full
signal transmitting potential of EVs.
A more profound knowledge of EV function may certainly contribute to further improve our
understanding of pathomechanisms and to identify players involved in asthma development.
Should EVs be proven to significantly contribute to asthmatic inflammatory processes, their
inhibition might represent a novel approach for individualized concepts of therapy. In addition,
EVs might also serve as tools for a better diagnosis of different asthma endotypes, since the
information they carry depends largely on the status of their originating cell. Furthermore, there
are attempts to instrumentalize EVs as a promising system for drug delivery into the human
body. Certainly, further improvement of methods will have a major impact on advances on the
still emerging but promising field of EV research.
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