The Rho GEF Trio is transported by microtubule plus-ends and involved in focal adhesion formation in migrating neural crest cells
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Directed cell migration depends on cytoskeletal rearrangements, protrusion formation, cell
contraction and focal adhesion turnover. These processes are regulated by spatiotemporal
fine-tuning of Rho GTPase activity. The Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) Trio
is well suited to control Rho GTPase activity by merging two catalytic GEF domains, allowing
control over Rac1 and RhoA within a single protein. However, strict spatiotemporal control of
the activity of the Trio GEF domains at the cellular level is necessary. We recently
demonstrated that Trio is required for Xenopus neural crest (NC) cell protrusion formation and
migration. Here, we examine the dynamic localization of Trio and its impact on Trio's role in
NC cell migration. Live-cell imaging revealed that the Trio GEF2 domain co-localizes with EB3
at microtubule plus-ends. Microtubule trafficking of Trio appears to be important for its function,
as a mutant GEF2 construct lacking the SxIP amino acid motif responsible for microtubule
plus-end binding, was unable to rescue the Trio loss-of-function induced NC migration defects
in vivo and in vitro. In addition, our analysis of microtubule dynamics in migrating neural crest
cells revealed that Trio knockdown results in the stabilization of microtubules at cell-cell
contacts, while destabilizing them at the leading edge compared to the control. Furthermore,
our findings indicate that Trio is involved in focal adhesion dynamics, as analyzed by live-cell
imaging of focal adhesion assembly and disassembly. Our data suggest that Trio is transported
by microtubules to specific subcellular locations, where it has distinct functions in controlling
microtubule stability, protrusion formation and adhesive functions during directed NC cell
migration. Furthermore, TRIO gene mutations have been shown to cause neurodevelopmental
disorders and facial dysmorphisms in patients, possibly by inhibiting the migration of neural
crest cells. Similar clinical features were observed in individuals with mutations in the MAPRE2
and TUBB genes. We successfully induced Mapre2 and Tubb loss-of-function in Xenopus
embryos by injecting specific translation-blocking morpholinos and demonstrate, comparable
to patient data, that this knockdown results in NC migration defects and craniofacial
malformations. These experiments will serve as a starting point to analyze whether Trio,
Mapre2 and Tubb operate within the same signaling pathways to regulate microtubule
dynamics, focal adhesion turnover and, thereby, cell motility.
Die gerichtete Zellmigration hängt von einem dynamischen Zytoskelett, der Bildung von
Zellfortsätzen, der Zellkontraktion und dynamischen fokalen Adhäsionen ab. Diese Prozesse
werden durch ein räumliches und zeitliches Feintuning der Aktivität von Rho-GTPasen
reguliert. Der Rho-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) Trio ist ein ausgezeichneter
Kandidat, um die Aktivität von Rho-GTPasen zu kontrollieren, da er zwei katalytische GEFDomänen
vereint und so die Kontrolle über Rac1 und RhoA in einem einzigen Protein
ermöglicht. Allerdings ist eine strikte räumliche und zeitliche Regulation der Aktivität der Trio-
GEF-Domänen auf zellulärer Ebene erforderlich. Wir konnten bereits zeigen, dass Trio für die
Bildung von Zellfortsätzen sowie für die gerichtete Zellmigration in Xenopus-
Neuralleistenzellen notwendig ist. In dieser Studie untersuchen wir die dynamische
Lokalisation von Trio und deren Einfluss auf seine Funktion bei der Neuralleistenzellmigration.
Die Lebendzellanalyse zeigte, dass die Trio-GEF2-Domäne mit EB3 an Miktotubuli-Plus-
Enden kolokalisiert. Der Transport von Trio durch Mikrotubuli scheint für seine Funktion wichtig
zu sein, denn ein mutiertes GEF2-Konstrukt, dem das Aminosäuremotiv SxIP fehlte, welches
für die Bindung an Mikrotubuli-Plus-Enden verantwortlich ist, konnte den Trio-Verlust in
Neuralleistenzellen in vivo und in vitro nicht ausgleichen, während das Wildtyp-GEF2-
Konstrukt dazu in der Lage war. Darüber hinaus zeigte unsere Analyse der Mikrotubuli-
Dynamik in migrierenden Neuralleistenzellen, dass der Trio-Knockdown zu einer Stabilisierung
der Mikrotubuli an Zell-Zell-Kontakten führt, während sie an der Zellfront im Vergleich zur
Kontrolle destabilisiert werden. Gleichzeitig deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Trio
an der Dynamik der fokalen Adhäsionen beteiligt ist. Zusammenfassend zeigen wir hier, dass
Trio über Mikrotubuli an spezifische subzelluläre Orte transportiert werden kann, wo es
verschiedene Funktionen bei der Kontrolle der Mikrotubuli-Stabilität, der Ausbildung von
Zellfortsätzen und der Zelladhäsion während der gerichteten Migration von Neuralleistenzellen
ausübt. Weiterhin wurde bereits gezeigt, dass TRIO-Genmutationen zu neurologischen
Entwicklungsstörungen und Gesichtsdysmorphien bei Patienten führen, möglicherweise durch
eine beeinträchtigte Neuralleistenzellmigration. Ähnliche klinische Merkmale wurden bei
Personen mit Mutationen in den Genen MAPRE2 und TUBB beobachtet. Wir konnten den
Funktionsverlust von Mapre2 und Tubb in Xenopus Embryonen durch Injektion spezifischer
translationsblockierender Morpholino Oligonukleotide nachahmen und zeigen, dass dieser in
Xenopus, ähnlich wie in Patienten, zu Defekten in der Neuralleistenzellmigration und zu
kraniofazialen Fehlbildungen führt. Diese Experimente dienen als Ausgangspunkt, um zu
analysieren, ob Trio, Mapre2 und Tubb innerhalb der gleichen Signalkaskaden agieren, um
die Mikrotubuli-Dynamik, die fokale Adhäsion und damit die Zellmotilität zu regulieren.