Heterologous protein expression of Hydra FGFs and siRNA approach to investigate FGF function
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
The fibroblast growth factor receptor (FGFR) signaling pathway is essential during eumetazoan development. It regulates key aspects of cellular physiology such as proliferation, differentiation, and migration during patterning and morphogenesis. Hydra, a simple freshwater polyp at the base of eumetazoan evolution, provides an ideal model to investigate FGFR signaling on the basis of its astonishing regenerative capability and constantly active patterning processes in the adult animal. Two FGFRs (FGFRa and FGFRb) have been identified in this polyp, as well as one truncated FGFR. In addition, five potential ligands (Hv-FGF-a, Hv-FGF-b, Hv-FGF-c, Hv-FGF-e, and Hv-FGF-f) are known.
FGFRa has an essential function during asexual reproduction of Hydra for detachment of the vegetative bud and according to unpublished pilot experiments, it might have additional functions in cell migration and differentiation. Migration of i-cells is prevented upon local or systemic inhibition of FGFR signaling and siRNA mediated knockdown of hv-fgf-c reduces the number of neurons and increases the number of I-cells.
The function of the five potential ligands is currently unknown, but they show each a specific transription pattern during in situ hybridization. On the basis of their differential transcription and siRNA knockdown experiments, Hydra FGFR signaling might selectively guide already committed interstitial cells and/or provide differentiation signals. To confirm this model, it is important to gain more conclusive evidence than manipulations on the pharmacological and RNA levels can provide. To gain further insights into the functions of FGFR signaling in Hydra, the aim of this project was the expression and purification of recombinant Hydra FGF proteins to investigate their effects on cell migration and differentiation in functional bioassays in vivo.
This study reports the difficulty of expressing soluble Hydra FGFs in prokaryotic cells, whereas denatured protein was purified from inclusion bodies. However, refolding the denatured proteins to their native, functional conformation did not produce sufficient yields. Expression of Hydra FGFs in mammalian HEK293T cells is much more promising since they have the ability to add eukaryotic post-translational modifications that might be integral to protein function.
Further hints as to the function of Hv-FGF-c were investigated through siRNA mediated knockdown, suggesting a possible involvement of Hv-FGF-c for proper spacing of battery cells during cell migration in the tentacles. The knockdown resulted in tentacles with extended battery nodules containing an irregular pattern of nematocytes.
In addition, ten novel, predicted Hydra FGFs were identified and first insights into potential functions given through analysis of their transcription. Each of the ten new Hv-FGFs shows a specific transcription pattern. However, more data is needed to complete the picture.
FGFR signaling in Hydra remains an exciting field. This study provides the basis for further investigations into the function of the ligands and towards functional bioassays with recombinant proteins.
Während der Entwicklung der Eumetazoa ist der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (FGFR) Signalweg von entscheidender Bedeutung. Er reguliert wichtige Aspekte der Zellphysiologie wie Proliferation, Differenzierung und Migration im Rahmen von Musterbildungsprozessen und Morphogenese. Hydra, ein einfacher Süßwasserpolyp an der Basis der Eumetazoen-Evolution, ist durch sein beeindruckendes Regenerationsvermögen und der auch im adulten Tier konstant aktiven Musterbildungsprozesse ein ideales Modell zur Untersuchung des FGFR Signalwegs. Zwei FGFR (FGFRa und FGFRb) wurden in Hydra identifiziert, sowie auch ein löslicher Rezeptor. Zudem sind fünf potentielle Liganden (Hv-FGF-a, Hv-FGF-b, Hv-FGF-c, Hv-FGFe und Hv-FGF-f) bekannt.
FGFRa übt eine essentielle Funktion während der Knospenablösung bei der asexuellen Reproduktion von Hydra aus. Unveröffentlichten Pilotexperimenten zufolge hat der Rezeptor während der Zellmigration und -differenzierung womöglich weitere Funktionen. Die Migration von interstitiellen Zellen ist durch die lokale oder systemische Inhibition des FGFR Signalwegs gestört und siRNA-vermittelter knockdown von hv-fgf-c reduziert die Anzahl von Neuronen und erhöht die Anzahl von interstitiellen Zellen.
Die Funktion der fünf potentiellen Liganden ist bisher unbekannt, jedoch zeigen sie in der in situ Hybridisierung je ein spezifisches TRanskriptionsmuster. Basierend auf dieser differenziellen Transkription und der siRNA knockdown Experimente, könnte der FGFR Signalweg selektiv bereits zur terminalen Differenzierung festgelegte interstitielle Zellen während ihrer Migration leiten und/oder als Differenzierungssignal fungieren. Um dieses Modell zu bestätigen sind Experimente nötig, die aufschlussreichere Hinweise liefern als das pharmakologische Manipulationen oder Störung auf dem RNA-Level vermögen. Das Ziel des vorliegenden Projekts war es, Hydra FGF Proteine rekombinant zu exprimieren, um deren Effekt auf die Zelldifferenzierung und -migration in funktionellen Bioassays in vivo zu untersuchen und weitere Einblicke in die Funktion des FGFR Signalwegs zu erhalten.
Diese Arbeit stellt die Schwierigkeiten dar, die die Expression von löslichen Hydra FGFs in einem prokaryotischen System mit sich bringt, während die Gewinnung von denaturiertem Protein aus inclusion bodies durchaus möglich war. Jedoch war die Rückfaltung der Proteine in ihre native, funktionelle Konformation mit Schwierigkeiten verbunden und erbrachte keine ausreichende Ausbeute. Die Expression der Hydra FGFs aus Säugerzellen (HEK293T) war vielversprechender, vor allem da in diesen Zellen eukaryotische post-transkriptionelle Modifikationen integriert werden, die essentiell für die Proteinfunktion sein könnten.
Weitere Hinweise auf die Funktion von Hv-FGF-c werden durch RNAi-vermittelten knockdown untersucht, die darauf hindeuten, dass Hv-FGF-c möglicherweise für die richtige Verteilung der Batteriezellen während der Zellmigration in den Tentakeln verantwortlich ist. Der knockdown führte zu Tentakeln mit ausgedehnten Batterieknötchen, die ein unregelmäßiges Muster von Nematocyten enthalten.
Zudem wurden zehn neue, potentielle Hydra FGFs identifiziert und erste Hinweise auf mögliche Funktionen durch Analyse der Transkription erbracht. Jedoch werden weitere Daten benötigt, um ein vollständiges Bild zu erhalten.
Der FGFR Signalweg in Hydra bleibt ein spannendes Forschungsfeld. Die vorliegende Arbeit begründet das Fundament für die weitergehende Erforschung der Funktion der FGF Liganden durch funktionelle Bioassays mit rekombinanten Proteinen.
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