Einfluss von PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase- Activating Polypeptide) bzw. des PACAP Rezeptors PAC1 auf Metabolismus, Morphologie und Expression pro- inflammatorischer/ oxidativen Stress- relevanter Proteine/ Zytokine in der Leber bei ApoE-/- Mäusen unter Normalfutter
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Atherosklerose gilt als chronische Entzündungserkrankung der Arterienwände und zählt zu den führenden Todesursachen weltweit. Sie zeichnet sich durch Läsionen (~ Plaques) in der Arterienwand aus. Durch Erosion oder Ruptur der Plaques können z.B. thrombotische Ereignisse, Embolie, Schlaganfall, Herzinfarkt oder im ungünstigsten Fall der Tod resultieren. Trotz intensiver Forschungen hat die Atherosklerose eine komplexe Pathogenese, die noch immer nicht komplett aufgeklärt ist. Lipidakkumulation und chronische Entzündung der Arterienwand gelten jedoch als Hauptkomponenten. Üblicherweise wird sie mit einem veränderten Lipidstoffwechsel und Hypercholesterinämie in Verbindung gebracht.
PACAP (engl. „Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide“) und sein spezifischer Rezeptor PAC1 sind an der Pathogenese atherosklerotischer/ inflammatorischer Prozesse beteiligt. Frühere Studien wiesen bereits neuroprotektive Wirkungen von PACAP mittels anti- apoptotischen, entzündungshemmenden und anti- oxidativen Eigenschaften nach sowie die Reduzierung von Steatosis hepatis.
Da die Leber im Fettstoffwechsel eine zentrale Rolle einnimmt und maßgeblich an systemischen Entzündungsreaktionen beteiligt ist, war es naheliegend den Einfluss von PACAP und PAC1 auf den Leberstoffwechsel untersucht werden, insbesondere auf Metabolismus und Expression pro- inflammatorischer/ oxidativen Stress- relevanter Proteine/ Zytokine.
Für die Untersuchungen wurden folgende drei Mausgenotypen verwendet: ApoE-/- (~ Kontrolle), PACAP-/-/ ApoE-/- und PAC1-/-/ ApoE-/-. Die Mäuse wurden für 30 Wochen mit Standardfutter ernährt. Im Anschluss wurden die Körpergewichte ermittelt und die Cholesterin- und Triglyceridkonzentrationen im Blutplasma und in der Leber gemessen. Zur weiteren Differenzierung inflammatorischer und metabolischer Vorgänge in der Leber erfolgten immunhistochemische Untersuchungen sowie Messungen der Aminosäurenkonzentrationen in der Leber.
Es zeigte sich ein signifikant um 16,9% niedrigeres Gewicht bei PACAP-/-/ApoE-/-- gegenüber den ApoE-/-- Mäusen. Alle drei untersuchten Genotypen ApoE-/-, PACAP-/-/ApoE-/-- und PAC1-/-/ApoE-/- waren hypercholesterinämisch. Die hepatische Triglyceridkonzentration bei PACAP-/-/ApoE-/-- Mäusen war signifikant um 53,9% niedriger als bei ApoE-/-- Mäusen.
Bei den immunhistochemischen Analysen war der prozentuale Anteil IL-1β positiver- Zellen um die ZV bei PACAP-/-/ ApoE-/-- Mäusen 1,2fach niedriger als bei den ApoE-/-- Mäusen. Wir fanden bei Ki-67 in der Leber von PAC1-/-/ ApoE-/--, aber nicht von PACAP-/-/ ApoE-/-- Mäusen, eine um 32,4% höhere Dichte um die GT als bei ApoE-/-- Mäusen. Der prozentuale Anteil Ki-67 positiver- Zellen war um die GT um 12,6% höher als bei ApoE-/-- Mäusen. Bei den PACAP-/-/ ApoE-/-- Mäusen waren die Aminosäurekonzentrationen in der Leber im Vergleich zu den ApoE-/-- Mäusen wie folgt erhöht: Citrullin (1,4fach), α- Aminobuttersäure (58,1%), Methionin (24,1%) und Ornithin (23%). Bei den PAC1-/-/ ApoE-/-- Mäusen waren die Aminosäurekonzentrationen in der Leber im Vergleich zu den ApoE-/-- Mäusen wie folgt erhöht: Citrullin (1,5fach), α- Aminobuttersäure (2,5fach) und Methionin (16,3%).
Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass PACAP- Defizienz eine erniedrigte hepatische Triglyceridkonzentration wie auch Gewichtsreduktion bewirkt.
Unsere Daten zeigen ferner, dass PACAP- Defizienz in der Leber anscheinend für ein erhöhtes anti- inflammatorisches Potential (s. COX-2, IL-1β) sorgt, während PAC1- Defizienz tendenziell zu einer vermehrten Proliferation (s. Ki-67) und Nekroptose (s. RIPK3) führt. Die positiven Korrelationen des prozentualen Anteils COX-2-, IL-1β-, Ki-67- bzw. RIPK3- positiver- Zellen, sowie der Dichte (n/mm2) MOMA-2 positiver Makrophagen/ Monozyten zwischen den GT und ZV könnten auf eine zonale Koinzidenz der Ereignisse in diesen beiden Bereichen der Leber hindeuten.
Erhöhte Methioninkonzentrationen in der Leber bei PACAP- bzw. PAC1- Defizienz könnten allerdings auf ein pro- inflammatorisches und pro- oxidatives Milieu in der Leber hindeuten. In Zusammenschau mit den erhöhten Konzentrationen an Citrullin bei PACAP-/-/ ApoE-/-- und PAC1-/-/ ApoE-/-- Mäusen könnten Methionin und Citrullin kompensatorisch vermehrt produziert worden sein, um eine Protektion gegen Steatosis hepatis zu bewirken. Diese Hypothese wird durch die signifikant niedrigerer Triglyceridkonzentration der Leber bestärkt. Die erhöhten Konzentrationen von Citrullin und Ornithin bei PACAP- und PAC1- Defizienz könnten auf einen gestörten Harnstoffzyklus bei gestörtem Lebermetabolismus zurückzuführen sein.
In Zusammenschau der Befunde könnte die therapeutische Inhibition von PACAP zur Reduzierung von Steatosis hepatis führen. Eine denkbare Nebenwirkung wäre dabei allerdings eine Hypercholesterinämie. Für weitere therapeutische Konsequenzen werden aber noch Studien folgen müssen. Zudem bleibt auch zu klären, welche Rolle PACAP (oder VIP) über VPAC1 und VPAC2 beim Leberstoffwechsel spielt.
Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the arterial walls and is one of the leading causes of death worldwide. It is characterized by lesions (~ plaques) in the arterial wall. Erosion or rupture of the plaques can result in thrombotic events, embolism, stroke, heart attack or, in the worst case, death. Despite intensive research, atherosclerosis has a complex pathogenesis that is still not fully understood. However, lipid accumulation and chronic inflammation of the arterial wall are considered to be the main components. It is usually associated with altered lipid metabolism and hypercholesterolemia. PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide) and its specific receptor PAC1 are involved in the pathogenesis of atherosclerotic/ inflammatory processes. Earlier studies have already demonstrated neuroprotective effects of PACAP by means of anti- apoptotic, anti- inflammatory and anti- oxidative properties as well as the reduction of steatosis hepatis. Since the liver plays a central role in lipid metabolism and is significantly involved in systemic inflammatory reactions, the influence of PACAP and PAC1 on liver metabolism, in particular on metabolism and expression of pro- inflammatory/ oxidative stress- relevant proteins/ cytokines, will be investigated.
The following three mouse genotypes were used for the studies: ApoE-/- (~ control), PACAP-/-/ ApoE-/- and PAC1-/-/ ApoE-/-. The mice received a standard diet for 30 weeks. Subsequently, body weights were determined and cholesterol and triglyceride concentrations in blood plasma and liver were measured. To further differentiate inflammatory and metabolic processes in the liver, immunohistochemical examinations and measurements of amino acid concentrations in the liver were carried out.
There was a significant 16.9% lower weight in PACAP-/-/ApoE-/-- compared to ApoE-/-- mice. All three investigated genotypes ApoE-/-, PACAP-/-/ApoE-/-- and PAC1-/-/ApoE-/- were hypercholesterolemic. The hepatic triglyceride concentration in PACAP-/-/ApoE-/-- mice was significantly lower by 53.9% than in ApoE-/-- mice.
In the immunohistochemical analyses, the percentage of IL-1β positive cells around the ZV was 1.2-fold lower in PACAP-/-/ ApoE-/-- mice than in ApoE-/-- mice. We found Ki-67 in the liver of PAC1-/-/ ApoE-/--, but not PACAP-/-/ ApoE-/-- mice, to be 32.4% higher in density around the GT than in ApoE-/-- mice. The percentage of Ki-67 positive cells around the GT was 12.6% higher than in ApoE-/- mice. In the PACAP-/-/ ApoE-/-- mice, the amino acid concentrations in the liver were increased compared to the ApoE-/-- mice as follows: citrulline (1.4-fold), α- aminobutyric acid (58.1%), methionine (24.1%) and ornithine (23%). In the PAC1-/-/ ApoE-/-- mice, amino acid concentrations in the liver were increased compared to the ApoE-/-- mice as follows: citrulline (1.5-fold), α- aminobutyric acid (2.5-fold) and methionine (16.3%). Our results suggest that PACAP deficiency causes decreased hepatic triglyceride concentrations as well as weight loss.
Our data also show that PACAP deficiency in the liver appears to result in increased anti-inflammatory potential (see COX-2, IL-1β), while PAC1 deficiency tends to lead to increased proliferation (see Ki-67) and necroptosis (see RIPK3). The positive correlations of the percentage of COX-2, IL-1β, Ki-67 and RIPK3 positive cells, as well as the density (n/mm2) of MOMA-2 positive macrophages/ monocytes between the GT and ZV may indicate a zonal coincidence of events in these two areas of the liver.
However, increased methionine concentrations in the liver in PACAP- or PAC1- deficiency could indicate a pro- inflammatory and pro- oxidative environment in the liver. In conjunction with the increased concentrations of citrulline in PACAP-/-/ ApoE-/-- and PAC1-/-/ ApoE-/-- mice, methionine and citrulline may have been produced in a compensatory manner to provide protection against steatosis hepatis. This hypothesis is supported by the significantly lower liver triglyceride concentration. The increased concentrations of citrulline and ornithine in PACAP and PAC1 deficiency could be due to a disturbed urea cycle with impaired liver metabolism.
In summary of the findings, therapeutic inhibition of PACAP could lead to a reduction in steatosis hepatis. However, one conceivable side effect would be hypercholesterolemia. However, further studies will have to follow to determine further therapeutic consequences. It also remains to be clarified what role PACAP (or VIP) plays in liver metabolism via VPAC1 and VPAC2.
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