Dynamics of cell wall binding proteins and membrane-associated secretion proteins at a single molecule level
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Protein secretion is an essential mechanism for cells, which has already been well-researched
in Gram-negative bacteria. In Gram-positive bacteria, however, homologs of known proteins
of the mechanism are missing, and how these are compensated is still unclear. A key factor in
protein secretion is SecA, which acts as a motor protein that pushes secretory proteins through
the SecYEG translocon. In Gram-negative bacteria, this protein is supported by the holdase
SecB. The interaction between SecA and SecB is not essential but increases efficiency.
In this work, several proteins involved in the secretion process were analyzed by single
molecule tracking. Unlike in E. coli, SecA of B. subtilis is not mainly located at the membrane,
where it binds to the Sec-translocon, but is predominantly found in the cytoplasm. The SecA
molecules are localized primarily in areas outside the nucleoid and copy the localization of
ribosomes, suggesting that SecA picks up secretory proteins directly at the ribosome and that
SecA in B. subtilis can take over the tasks of SecA and SecB in E. coli. It was also shown that
the size of the static population, which represents SecA engaged in substrate translocation,
depends on the growth phase of the cell culture, indicating adaptation of SecA dynamics
according to the distinct cellular requirements.
Furthermore, the behavior of SecA, SecDF, YidC, and FtsY was investigated in case of an
overproduction of the secretory protein AmyE. It was found that not only SecA becomes more
strongly engaged in substrate translocation during overproduction, but also FtsY, belonging to
the signal recognition particle pathway for integration of membrane proteins. Proteins SecDF,
implicated in secretion, and YidC, a membrane integrase, do not change their single molecule
behavior. These data suggest that the SRP system might take over SecA substrate proteins
during overexpression conditions.
A large class of secretory proteins translocated by the SecA system are cell wall hydrolases
(autolysins). To better understand how they move within and/or along the cell wall, the
dynamics of LytC and LytF were analyzed. LytC is one of the main autolysins in B. subtilis and
localizes around the cell, whereas LytF is mainly involved in cell division and is, therefore,
mostly found at the septa and poles. A three-population fit was found to be the best for both
proteins. The fastest diffusion constant was comparable to freely diffusing proteins observed
in the cytoplasm, which would support the existence of a periplasmic space. Molecules
belonging to the population with a slow mobile diffusion constant are most likely proteins that
move along the cell wall searching for targets. For comparison, the observed diffusion constant
is similar to that of DNA-binding proteins sliding through the genome. The static population,
confined to the periphery of cells, likely corresponds to autolysins engaged in substrate
hydrolysis. The investigation of the dynamics of the cell wall hydrolases LytC and LytF inV
different deletion strains showed that the localization of the proteins is not only determined by
the cell wall binding domains, as stated in the literature, but also by other cell wall hydrolases
and inhibitory proteins, whose absence strongly influenced the dynamics as well as preferred
dwell sites of the investigated cell wall hydrolases. These findings indicate an intricate interplay
of the many redundant autolysins and their inhibitors within the cell wall.
With regard to secretion efficiency, this work revealed a possible connection between cell wall
hydrolases and protein secretion, indicating that the activity of cell wall hydrolases increases
the secretion rate of AmyE. This finding supports the idea that the secretion of large proteins
through the cell wall requires areas of loosened connections in the cell wall for the passage of
proteins into the surrounding environment.
Die Proteinsekretion ist ein essentieller Mechanismus für Zellen, der bei Gram-negativen
Bakterien bereits gut erforscht ist. Bei Gram-positiven Bakterien fehlen jedoch Homologe
bekannter Proteine des Mechanismus, und wie diese kompensiert werden, ist noch unklar. Ein
Schlüsselfaktor bei der Proteinsekretion ist SecA, das als Motorprotein fungiert und
sekretorische Proteine durch das SecYEG-Translocon schiebt. In Gram-negativen Bakterien
wird dieses Protein von der Holdase SecB unterstützt. Die Interaktion zwischen SecA und
SecB ist nicht essentiell, erhöht aber die Effizienz.
In dieser Arbeit wurden mehrere am Sekretionsprozess beteiligte Proteine durch
Einzelmolekülverfolgung analysiert. Anders als in E. coli ist SecA in B. subtilis nicht
hauptsächlich an der Membran lokalisiert, wo es an das Sec-Translocon bindet, sondern
befindet sich überwiegend im Zytoplasma. Die SecA-Moleküle sind vor allem in Bereichen
außerhalb des Nukleoids lokalisiert und zeigen eine vergleichbare Lokalisation mit der von
Ribosomen, was darauf hindeutet, dass SecA sekretorische Proteine direkt am Ribosom
aufnimmt und dass SecA in B. subtilis die Aufgaben von SecA und SecB in E. coli übernehmen
kann. Es wurde auch gezeigt, dass die Größe der statischen Population, die SecA bei der
Substrattranslokation repräsentiert, von der Wachstumsphase der Zellkultur abhängt, was auf
eine Anpassung der SecA-Dynamik an die unterschiedlichen zellulären Anforderungen
hinweist.
Außerdem wurde das Verhalten von SecA, SecDF, YidC und FtsY im Falle einer
Überproduktion des sekretorischen Proteins AmyE untersucht. Es zeigte sich, dass nicht nur
SecA bei einer Überproduktion stärker an der Substrattranslokation beteiligt ist, sondern auch
FtsY, das zum Signalerkennungspartikel-Weg (signal recognition particle, SRP) für die
Integration von Membranproteinen gehört. Die Proteine SecDF, die an der Sekretion beteiligt
sind, und YidC, eine Membranintegrase, ändern ihr Einzelmolekülverhalten nicht. Diese Daten
deuten darauf hin, dass das SRP-System die SecA-Substratproteine unter
Überexpressionsbedingungen übernehmen könnte.
Eine große Klasse von sekretorischen Proteinen, die durch das SecA-System verlagert
werden, sind Zellwandhydrolasen (Autolysine). Um besser zu verstehen, wie sie sich innerhalb
und/oder entlang der Zellwand bewegen, wurde die Dynamik von LytC und LytF analysiert.
LytC ist eines der wichtigsten Autolysine in B. subtilis und ist in der ganzen Zelle lokalisiert,
während LytF hauptsächlich an der Zellteilung beteiligt ist und sich daher hauptsächlich an
den Septen und Polen befindet. Eine Drei-Populations-Fit erwies sich für beide Proteine als
die beste. Die schnellste Diffusionskonstante war vergleichbar mit frei diffundierenden
Proteinen, die im Zytoplasma beobachtet wurden, was für die Existenz einesVII
periplasmatischen Raums sprechen würde. Moleküle, die zu der Population mit einer
langsamen mobilen Diffusionskonstante gehören, sind höchstwahrscheinlich Proteine, die sich
auf der Suche nach Zielen entlang der Zellwand bewegen. Zum Vergleich: Die beobachtete
Diffusionskonstante entspricht derjenigen von DNA-bindenden Proteinen, die durch das
Genom gleiten. Die statische Population, die auf die Peripherie der Zellen beschränkt ist,
entspricht wahrscheinlich den Autolysinen, die mit der Substrathydrolyse beschäftigt sind. Die
Untersuchung der Dynamik der Zellwandhydrolasen LytC und LytF in verschiedenen
Deletionsstämmen zeigte, dass die Lokalisierung der Proteine nicht nur durch die
Zellwandbindungsdomänen bestimmt wird, wie in der Literatur angegeben, sondern auch
durch andere Zellwandhydrolasen und inhibitorische Proteine, deren Abwesenheit die
Dynamik sowie die bevorzugten Lokalisation der untersuchten Zellwandhydrolasen stark
beeinflusst. Diese Ergebnisse deuten auf ein kompliziertes Zusammenspiel der vielen
redundanten Autolysine und ihrer Inhibitoren innerhalb der Zellwand hin.
Im Hinblick auf die Sekretionseffizienz zeigte diese Arbeit einen möglichen Zusammenhang
zwischen Zellwandhydrolasen und Proteinsekretion auf, der darauf hindeutet, dass die
Aktivität von Zellwandhydrolasen die Sekretionsrate von AmyE erhöht. Diese Erkenntnis
unterstützt die Idee, dass die Sekretion großer Proteine durch die Zellwand Bereiche mit
gelockerten Verbindungen in der Zellwand erfordert, damit die Proteine in die Umgebung
gelangen können
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