Untersuchungen zur gezielten Behandlung FLT3-ITD-positiver AML-Zellen mit hohen SKI-Leveln mit verschiedenen Inhibitoren
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
In dieser Arbeit sollte die Rolle von SKI in der Behandlung FLT3-ITD-positiver AML-Zellen untersucht werden. SKI zählt durch seine transformierende Aktivität als Leukämie-induzierendes Onkogen und spielt eine Rolle bei der Regulation verschiedener Signalwege. Da SKI die FLT3-Expression heraufreguliert und SKI-positive AML-Patient:innen mit FLT3-ITD-Mutation eine schlechtere Prognose aufweisen als SKI-negative AML-Patienten mit FLT3-ITD-Mutation, trägt ein gezieltes therapeutisches Angreifen von SKI das Potenzial, die Prognose dieser Patient:innen zu verbessern. Basierend auf bereits identifizierten SKI-abhängigen Faktoren haben wir verschiedene Zellkulturinhibitoren ausgewählt, die speziell bei FLT3-ITD-positiven AML-Zellen mit hohen SKI-Leveln wirksam sein könnten. Um ein unterschiedliches Ansprechen zwischen ±SKI beobachten zu können, wurde SKI mittels CRISPR/Cas9-Technologie in MV4-11-Zellen (FLT3-ITD-positive AML-Zellen mit endogen erhöhten SKI-Leveln) ausgeschaltet und die Zellviabilität mittels CellTiter-Glo-Assay nach Behandlung der MV4-11-Zellen ±SKI bestimmt.
Dabei konnten wir zeigen, dass die SKI-positiven MV4-11-Zellen signifikant besser auf eine Einzelbehandlung mit dem PIM-Inhibitor AZD1208 ansprachen. Dies macht AZD1208 zu einem vielversprechenden Inhibitor zur Behandlung FLT3-ITD-positiver AML mit hohen SKI-Leveln.
Weiterhin haben sich die Kombinationen von AZD1208 mit dem FLT3-TKI Sorafenib, dem PI3K-Inhibitor CAL101 sowie dem HDAC-Inhibitor LBH589 als sehr effektiv für die Behandlung der +SKI-MV4-11-Zellklone gezeigt und stellen somit potenzielle neue Kombinationsbehandlungen bei FLT3-ITD-positiver AML mit hohen SKI-Leveln dar. Hervorzuheben ist, dass die Zugabe von AZD1208 stets einen signifikant stärkeren inhibitorischen Effekt auf die +SKI- als auf die -SKI-MV4-11-Zellklone zeigte. Hohe SKI-Level scheinen demnach zu einer höheren Sensitivität gegenüber dem PIM-Kinase-Inhibitor AZD1208 in MV4-11-Zellen zu führen und könnten ein geeignetes Therapieziel darstellen. Dies betont die Bedeutung des Onkoproteins SKI als neues Zielgen in der Behandlung von FLT3-ITD-positiver AML. Eine Testung auf das Vorliegen einer Überexpression von SKI bei FLT3-ITD-positiver AML hätte somit sowohl einen prognostischen Wert als auch eine therapeutische Konsequenz, da durch die Weiterentwicklung dieser vielversprechenden Behandlungsmöglichkeiten die Prognose dieser Patient:innen in Zukunft verbessert werden könnte.
Weiterhin zeigte der Mitose-Hemmer Vincristin bereits im picomolaren Konzentrationsbereich einen hochpotenten zytotoxischen Effekt mit signifikant besserem Ansprechen der -SKI- als der +SKI-Zellen. Daraus können wir schlussfolgern, dass die Expression von SKI den zytotoxischen Effekt von Vincristin in FLT3-ITD-positiven AML-Zellen zu hemmen scheint und ein SKI-Targeting eine Resensitivierung gegenüber Vincristin herbeiführen könnte.
The aim of this study was to investigate the role of SKI in the treatment of FLT3-ITD-positive AML cells. SKI is a leukemia-inducing oncogene due to its transforming activity and plays a role in the regulation of various signaling pathways. Since SKI upregulates FLT3 expression and SKI-positive AML patients with FLT3-ITD mutation have a worse prognosis than SKI-negative AML patients with FLT3-ITD mutation, targeting SKI therapeutically has the potential to improve the prognosis of these patients. Based on previously identified SKI-dependent factors, we have selected several inhibitors that may be effective in FLT3-ITD-positive AML cells with high SKI levels. To observe a different response to the treatment between ±SKI, SKI was knocked out using CRISPR/Cas9 technology in MV4-11 cells (FLT3-ITD-positive AML cells with endogenously elevated SKI levels) and cell viability was determined using CellTiter-Glo assay after treatment of MV4-11 cells ±SKI.
We were able to show that the SKI-positive MV4-11 cells responded significantly better to a single treatment with the PIM inhibitor AZD1208. This qualifies AZD1208 as a promising inhibitor for the treatment of FLT3-ITD-positive AML with high SKI levels.
Furthermore, the combinations of AZD1208 with the FLT3-TKI sorafenib, the PI3K inhibitor CAL101 and the HDAC inhibitor LBH589 have been shown to be very effective for the treatment of +SKI-MV4-11 cell clones and thus represent potential new combination treatments for FLT3-ITD-positive AML with high SKI levels. It should be emphasized that the addition of AZD1208 always showed a significantly stronger inhibitory effect on the +SKI than on the -SKI-MV4-11 cell clones. Consequently, high SKI levels appear to lead to a higher sensitivity to the PIM kinase inhibitor AZD1208 in MV4-11 cells and could represent a suitable therapeutic target. This emphasizes the importance of the oncoprotein SKI as a new target gene in the treatment of FLT3-ITD-positive AML. Testing for the presence of overexpression of SKI in FLT3-ITD-positive AML would therefore have both a prognostic value and a therapeutic consequence, as the further development of these promising treatment options could improve the prognosis of these patients in the future.
Furthermore, the mitotic inhibitor vincristine showed a highly potent cytotoxic effect at picomolar concentrations with a significantly better response of -SKI than +SKI cell clones. From this we can conclude that the expression of SKI appears to inhibit the cytotoxic effect of vincristine in FLT3-ITD-positive AML cells and that targeting SKI may eventually lead to resensitization to vincristine.
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