Structural and functional analysis of proteins involved in the fungal cell wall maturation
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Pilze besitzen eine Zellwand, welche aus Polysacchariden und Proteinen besteht. Diese ist für die Zellen essentiell, da sie an Anpassungen, Zellteilung und dem Schutz vor Umwelteinflüssen beteiligt ist. Ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand sind unter anderem die Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerten Proteine, welche mit Hilfe von Glykosyl-Hydrolasen (GH) in die Zellwand eingebaut werden. Dies erfolgt über Spaltung und Neuverknüpfung von glykosidischen Bindungen. In der Bäckerhefe Saccharomyces. cerevisiae (S. cerevisiae) erfolgt dies über Glykosyl Hydrolasen (GH76 Familie) der Dfg5-Unterfamilie, welche in der Lage ist α1,4-Bindungen zwischen Glucosamin and Mannose des GPI-Ankers zu spalten und das GPI-verankerte Protein durch eine Transglykosilierung kovalent an die Zellwand zu knüpfen. Die Funktionen von GH76-Vertretern anderer Unterfamilien ist noch nicht genauer untersucht und stellt somit die Frage über mögliche Substrate dieser Enzymfamilie.
Damit GPI-verankerte Proteine zum Einbau in die Zellmembran und Zellwand zur Verfügung stehen, müssen diese mittels der sogenannten GPI-Transamidase im Endoplasmatischen Retikulum mit einem GPI-Anker, an ihrem C-terminalen Ende, ausgestattet werden. Dieser Schritt ist für S. cerevisiae essentiell. Generell sind GPI-verankerte Proteine in vielen Eukaryoten wichtig und Störungen der Synthese können zu diversen Krankheiten führen, wie die Paroxymale nächtliche Hämoglobinurie. Die genaue Funktionsweise des GPI-Transamidase-Komplexes ist bisher aufgrund fehlender Kristallstrukturen noch nicht vollends geklärt.
Um diese Wissenslücken zu schließen, wurde zum einen die katalytische Untereinheit der GPI Transamidase aus Hefe rekombinant in Escherichia coli (E. coli) produziert und aufgereinigt. Bestehendes Wissen über dieses Caspase-ähnliche Protein konnte bestätigt werden und deuten darauf hin, dass ScGpi8 alleine katalytisch inaktiv ist und vermutlich andere Proteine des Komplexes benötigt. Zum anderen wurde ein weiterer Vertreter der GH76-Familie der Fungal/Bacterial-mixed-Unterfamilie, aus Chaetomium thermophilum, strukturell und funktionell genauer analysiert. Hierbei konnten neue Einblicke in die Funktion und Substratbindung dieser Unterfamilie gewonnen und das generelle Bild der GH76-Familie erweitert werden. Die erzielte Kristallstruktur zeigte, dass die generelle Struktur und das aktive Zentrum in dieser Enzymfamilie zwar konserviert ist, die Funktionen aber von Unterfamilie zu Unterfamilie variabel sind. Im Gegensatz zu früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass CtGH76 möglicherweise doch über eine α1,6-Mannanaseaktivität verfügt und sich somit von der Funktion der Dfg5-Proteine unterscheidet, beziehungsweise ein anderer Mechanismus zur Verarbeitung von GPI verankerten Proteinen verwendet wird.
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