Entwicklung einer Real-Time PCR zum Nachweis von Streptococcus agalactiae auf Basis der 16S rRNA unter Verwendung der Reverse-Transkriptase Reaktion
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Als Ergänzung zur klassischen mikrobiologischen Diagnostik wurden in den letzten Jahrzehnten vermehrt molekularbiologische Methoden etabliert, die den Nachweis von Nukleinsäuren direkt aus dem Patientenmaterial innerhalb kurzer Zeit ermöglichen. Die DNA-basierte PCR-Analytik ist die am meisten verbreitete Methode.
Bei Proben mit geringer Erregerdichte und einem daraus resultierenden hohen Risiko für falsch-negative Ergebnisse bietet die Verwendung der zahlenmäßig weit überlegenen ribosomalen RNA als Zielmolekül einen vielversprechenden Ansatz. Abhängig vom Bakterium liegt die Anzahl der Ribosomen pro Zelle zwischen 100 und 10.000. Bisher jedoch fand dieses Konzept keine breite Anwendung. Bis heute existiert kein kommerzieller Test zur Identifizierung von Pathogenen, der auf spezies-spezifischer 16S rRNA basiert. Das steht im Widerspruch zu Erfahrungen auf dem benachbarten Gebiet der medizinischen Virologie, wo virale RNA im gleichen Maße wie DNA als Zielmolekül dient.
Diese Arbeit untersuchte das Potenzial der 16S rRNA als neuen molekularen Marker für den PCR-basierten Nachweis am Beispiel des Erregers Streptococcus agalactiae. Ein zentraler Fokus lag auf der Entwicklung und Optimierung einer 16S rRNA-basierten Reverse-Transkriptase-qPCR und der Darstellung der Sensitivitätssteigerung gegenüber der Standard-qPCR.
Ribosomale RNA-Moleküle weisen strukturelle Besonderheiten auf, wie chemische Modifikationen und komplexe Faltungen, die die Reaktionsdynamik beeinflussen können und daher berücksichtigt werden müssen.
Eine softwaregestützte Analyse auf DNA- und RNA-Ebene wurde benutzt, um den potenziellen Einfluss der räumlichen Anordnungen der 16S-Sequenz auf einzelne Schritte der RT-qPCR-Reaktion zu untersuchen. Mithilfe von In-silico-Simulationen wurde eine Auswahl an Primern für das Screening getroffen und vorläufige Reaktionsparameter für die RT-qPCR ermittelt.
Die Etablierung einer robusten Real-Time-PCR (qPCR) war ein essenzieller Zwischenschritt in dieser Arbeit. Diese Standard-qPCR sollte im späteren Verlauf als Referenzmethode dienen und einen direkten Vergleich mit der Reverse-Transkriptase-qPCR ermöglichen. Darüber hinaus sollte sie als Werkzeug zur Quantifizierung von Einflussfaktoren und zur Optimierung der Variablen in der reversen Transkription fungieren. Anschließend erfolgte die Etablierung und Charakterisierung der reversen Transkription.
Durch experimentelle Primer-Selektion in Kombination mit der Auswahl an Enzymen und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte eine Real-Time PCR etabliert werden, die zum Nachweis der bakteriellen genomischen DNA sowie der von rRNA abgeleiteten cDNA diente und eine Sensitivität von bis zu 50 Genomäquivalenten erreichte. Die der qPCR vorgeschaltete reverse Transkription führte zu einer Steigerung der Gesamtmenge an DNA-Matrizen um Faktor 100 bis 1000 und bestätigte die Ergebnisse einer japanischen Arbeitsgruppe, die eine ähnliche Erhöhung der diagnostischen Sensitivität bei Einsatz von rRNA anstelle von DNA am Beispiel von S. aureus und P. aeruginosa gezeigt hatten.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die angestrebte Steigerung der Sensitivität im RT-qPCR-Verfahren im Vergleich zur herkömmlichen qPCR-Methode entscheidend von der Menge der cDNA-Moleküle und somit von der Effizienz der reversen Transkription abhängt. Diese Arbeit unterstützt weiterhin die Hypothese, dass 16S rRNA als Target für diagnostische Anwendungen dienen kann. Der potenzielle Nutzen liegt darin, dass die vorgeschaltete reverse Transkription die Nachweisgrenze der qPCR erweitern und die Häufigkeit falsch-negativer Ergebnisse, insbesondere bei Proben mit geringen Mengen an genomischer DNA, reduzieren kann.
Weitere Studien sind notwendig, um die Methode für den klinischen Alltag weiter zu optimieren und zu evaluieren.
In addition to classical microbiological diagnostics, molecular biological methods have increasingly been developed over the past decades, enabling the detection of nucleic acids directly from patient material within a short period of time. DNA-based PCR analysis is the most widely used method.
In samples with low bacterial counts and a high risk of false-negative results, the use of multi-copy targets like the abundant ribosomal RNA offers a promising approach for the diagnosis of neonatal sepsis. Depending on the target bacterium, the number of ribosomes per cell ranges from 100 to 10,000. To date, this concept has not been widely adopted. At present, there are no commercially available tests for pathogen identification based on species-specific 16S rRNA. This is in contrast to medical virology, where viral RNA is used as frequently as DNA.
This study investigated the potential of 16S rRNA as a novel molecular marker for PCR-based detection, using the example of the pathogen Streptococcus agalactiae. A central focus was on the development and optimization of a 16S rRNA-based reverse transcription polymerase chain reaction with the aim of demonstrating increased sensitivity compared to DNA-based qPCR method.
In contrast to DNA, ribosomal RNA molecules exhibit distinctive structural characteristics, such as chemical modifications and complex folding patterns, which can impact reaction dynamics and thus require careful consideration.
A software-assisted analysis at the DNA and RNA levels was utilized to examine the potential influence of secondary structures of the 16S sequence on specific steps of the RT-qPCR reaction. Using in-silico simulations a set of primers was chosen for screening, and preliminary reaction parameters for the RT-qPCR were determined.
The development of a robust real-time PCR (qPCR) was an essential intermediate step in this study. This standard qPCR was intended to serve as a reference method for direct comparison with the reverse transcription qPCR. Additionally, it was to be used as a tool for quantifying influencing factors and optimizing variables in reverse transcription process. Following this, the reverse transcription step was developed and characterized.
Using experimental primer selection, combined with the choice of enzymes and optimization of reaction conditions, a real-time PCR (qPCR) was developed for detecting both bacterial genomic DNA and cDNA derived from rRNA. This method achieved a sensitivity of up to 50 genome equivalents. The reverse transcription step preceding the qPCR resulted in a 100 to 1000-fold increase in the total amount of DNA templates. This confirmed the results of a Japanese research group, which reported a similar increase in diagnostic sensitivity when using rRNA instead of DNA for the detection of S. aureus and P. aeruginosa.
The results of this study demonstrate that the sensitivity increase in the RT-qPCR method, compared to the qPCR, is significantly dependent on the amount of cDNA molecules and thus on the efficiency of reverse transcription. This study further supports the hypothesis proposing 16S rRNA as a useful additional target for diagnostic applications. The potential benefit lies in the fact that the preceding reverse transcription can extend the detection limit of qPCR and reduce the frequency of false-negative results, especially in samples with low amounts of genomic DNA.
Further invistgations are necessary to optimize and evaluate the method for suitability in routine clinical practice.
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