Die Rolle der Autophagie in der NASH : Eine molekulare in vivo und in vitro Untersuchung
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Die „nicht Alkohol assoziierte Steatohepatitis“ (NASH), eine Unterform der „nichtalkoholische Fettleber-Erkrankung“ (NAFLD), ist die Manifestation des metabolischen Syndroms in der Leber. Histologisch ist NASH durch eine vermehrte Fetteinlagerung ins Lebergewebe mit Entzündung und Zellschädigung gekennzeichnet, die mit oder ohne Fibroseentwicklung einhergeht. Durch die Erkrankung steigt das Risiko für eine Leberzirrhose und die Entwicklung eines „hepatozellulären Karzinoms“ (HCC). Die weltweit wachsenden Patientenzahlen führen zu einem zunehmenden Bedarf an Therapie und deren Verbesserung. Diese Arbeit dient dem besseren Verständnis der Rolle der Autophagie für die Pathophysiologie der NASH, um mögliche neue Therapieansätze zu finden.
In Hepatozyten wirkt sich die Autophagie durch die Reduktion von oxidativem Stress und dem Erhalt der Zellhomöostase protektiv aus. In Sternzellen wiederum führt die Aktivität der Autophagie zum Anstoß von Prozessen, welche Fibrosierung und Entzündung fördern. Des Weiteren wird die Rolle von Leptin, einem Regulatorhormon der Nahrungsaufnahme und Energiehomöostase, sowie von Koffein als supportiver Therapieoption untersucht. Sowohl Leptin als auch Koffein könnten ein wichtiges Bindeglied zwischen der Autophagie, dem metabolischen Syndrom und NASH darstellen.
Für die Untersuchung wird mittels RT-qPCR und Western Blot das Lebergewebe von übergewichtigen „fatty liver Shionogi“ (FLS)-Mäusen (ein Modell für NAFLD) und FLS-ob/ob-Mäusen (ein Modell für NASH) in Bezug auf die Autophagieaktivität verglichen. Zusätzlich dazu wird an humanen in vitro Modellen der Leber mittels HepG2-Zellen, Hep3B-Zellen und LX2-Zellen, die zur Simulation der Steatose der Leber jeweils mit „Ölsäure“ (OA) vorbehandelt sind, die Aktivität der Autophagie untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass ohne Leptin in fettleibigen Mäusen, die als Modell für NASH dienen, die Expression der mRNA von Becn1, Map1lc3b, Sqstm1, Prkaa1_2 und Prkaa2_2 und deren Proteine steigt. Die untersuchten Zelllinien exprimieren kein Leptin und sind demzufolge mit den FLS-ob/ob-Mäusen vergleichbar. Durch die Behandlung mit OA reichert sich vermehrt Fett in den Zellen der in vitro Modelle an. In der Live-Zellanalyse der Hep3B-Zellen ist ein vermehrter Reifungsprozess zum Autolysosom zu beobachten. In den HepG2-Zellen lassen sich nach der Behandlung mit OA weniger Autophagieproteine nachweisen, während PHOSPHO-AMPK-α vermehrt gebildet wird. Wird den Zellen zusätzlich Koffein zugesetzt, kehrt sich der Effekt um. In den LX2-Zellen stellt es sich ähnlich dar, allerdings wird in den Sternzellen PHOSPHO-AMPK-α stabil exprimiert. Daneben führt die Behandlung mit OA in den Sternzellen dazu, dass COL1A1 stärker exprimiert und marginal mehr Kollagen I Fibrillen gebildet werden.
In der Zusammenschau zeigt sich, dass das Fehlen von Leptin in übergewichtigen FLS-Mäusen die Autophagie behindert. Die Hemmung in den ob/ob-Mäusen ist Phospho-Ampk-α unabhängig. Demgegenüber zeigt sich in den Leptin-defizienten Zellenmodellen durch die Zugabe von OA eine Steigerung der Autophagie. In den HepG2-Zellen könnte die Steigerung PHOSPHO-AMPK-α vermittelt sein. Die Wirkung des Koffeins scheint hingegen maßgeblich davon abzuhängen, ob zum Startzeitpunkt der Koffeinbehandlung bereits eine Verfettung der Hepatozyten besteht. Sollte ein Mangel an Autophagie ursächlich für die Progredienz der NASH sein, wäre Koffein als Therapieoption nur bei bestimmten Verfettungsgraden hilfreich. Hingegen werden die Sternzellen auch bei bestehender Verfettung durch Koffein in ihrer Aktivität gehemmt, was ein Fortschreiten der Fibrosierung verhindert.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Leptin aufgrund seiner Rolle in der Autophagie ein vielversprechender Therapieansatz für NASH ist. Nichtsdestotrotz sind weitere Forschungen nötig, um die genauen molekularen Interaktionen, die zur Entwicklung von NASH führen, besser zu verstehen.
“Non-alcoholic steatosis hepatis” (NASH) belongs to and derives from “Non-alcoholic fatty liver disease” (NAFLD). Such metabolic syndrome is characterized by increased fat storage in hepatocytes, exacerbated cell death, and inflammation, even in the absence of liver fibrosis. NASH promotes liver cirrhosis and tumorigenesis, thus leading to “hepatocellular carcinoma” (HCC). The numbers of patients in need for better treatment and new therapeutic options is constantly increasing worldwide. This study aims to investigate the involvement of autophagy in the pathogenesis of NASH to identify new potential therapeutic approaches.
Autophagy plays an important role in protecting hepatocytes from cytotoxic stress and harmful cellular conditions. Moreover, it leads to trans-activation of the hepatic stellate cells, thus exerting a pro-fibrotic property and releasing pro-inflammatory metabolites. Furthermore, Leptin, a hormone that regulates hunger, and caffeine, an often-used therapy option, are investigated regarding their effects on autophagy and their implication for the metabolic syndrome and NASH.
RT-qPCR and Western Bolt detected autophagy markers in liver biopsies of obese “fatty liver Shionogi” FLS-mice (a model for NAFLD) and FLS-ob/ob-mice (a model for NASH). Additionally, HepG2, Hep3B and LX2 cells incubated with “oleic acid” (OA) were included in the study as a human in vitro model of liver steatosis.
The results show that in obese mice affected by NASH the absence of leptin expression is responsible for the over-expression of Becn1, Map1lc3b, Sqstm1 Prkaa1_2 und Prkaa2_2 transcripts as well as the accumulation of their proteins. The cells do not express leptin and are therefore comparable to FLS-ob/ob-mice. The administration of oleic acid causes an accumulation of fat in all leptin-deficient cells. The live-cell analyses show the maturation of autophagosome vesicles in OA-treated Hep3B cells. After treatment with OA, HepG2-cells reduce autophagy proteins and increase production of PHOSPHO-AMPK-α. This effect is reverted by adding caffeine. LX2-cells show similar results. In contrast, PHOSPHO-AMPK-α is stable in comparison to untreated cells. The administration of oleic acid increases the COL1A1 transcript level and marginally increases synthesis of inducible collagen I fibres in hepatic stellate cells.