Loading...
Files
Date
Publisher
Philipps-Universität Marburg
Abstract
In this thesis, Escherichia coli was engineered into growth-coupled biosensors with the capacity to detect a range of biologically and industrially relevant compounds with high specificity and sensitivity. Specifically, strains were developed to sense glycolaldehyde (GA) and glycerate by coupling their detection to essential metabolic processes through synthetic auxotrophies.
Two distinct GA biosensors were created: one based on pyridoxal-5-phosphate (PLP) auxotrophy and another on 2-ketoglutarate (2KG) auxotrophy. The PLP-based GA sensor was engineered by disrupting the canonical PLP biosynthesis pathway and redirecting it through an alternative GA-dependent route. In the 2KG-based sensor, the detection of GA was linked to a novel biosynthesis pathway of 2KG. Both types of sensor were subjected to extensive characterization and optimization to enhance GA detection, achieving an operational range that extends three orders of magnitude of GA concentration.
Furthermore, the GA biosensors were evaluated for in situ GA production through various metabolic pathways, including the oxidation of ethylene glycol, the Dahms and Weimberg pathways for xylose catabolism, demonstrating therefore their versatility and sensitivity. Moreover, new-to-nature enzymatic reactions for glycolate reduction were successfully implemented, highlighting the potential of these sensors for investigating synthetic metabolic networks in vivo.
In parallel, glycerate biosensors were developed by linking the synthesis of serine, an essential amino acid, to the presence of glycerate, providing an alternative to existing sensors that disrupt central carbon metabolism. The glycerate sensors presented here offer enhanced stability and accuracy in detecting glycerate. Additionally, a previously charactherized glycerate sensor was further engineered to improve its suitability for long-term cultivations. During this process, a novel function of the well-characterized succinate semialdehyde dehydrogenase enzyme was discovered.
The work presented here advances the fields of biotechnology and metabolic engineering by providing biosensors with the potential to serve as tools for the synthetic biology community.
In dieser Arbeit wurde Escherichia coli zu wachstumsgekoppelten Biosensoren mit der Fähigkeit entwickelt, eine Reihe von biologisch und industriell relevanten Substanzen mit hoher Spezifität und Sensitivität zu erkennen. Insbesondere wurden Stämme entwickelt, die Glykolaldehyd (GA) und Glycerat erkennen, indem sie deren Nachweis mittels synthetischer Auxotrophien an wesentliche Stoffwechselprozesse koppeln.
Es wurden zwei verschiedene GA-Biosensoren entwickelt: einer basierend auf Pyridoxal-5-Phosphat (PLP)-Auxotrophie und einer basierend auf 2-Ketoglutarat (2KG)-Auxotrophie. Der PLP-basierte GA-Sensor wurde durch Unterbrechung des kanonischen PLP-Biosynthesewegs und Umleitung über einen alternativen GA-abhängigen Weg entwickelt. Beim 2KG-basierten Sensor wurde die GA-Erkennung mit einem neuartigen Biosyntheseweg von 2KG verknüpft. Beide Sensortypen wurden einer intensiven Charakterisierung und Optimierung unterzogen, um die GA-Erkennung zu verbessern und einen Einsatzbereich zu erreichen, der drei Größenordnungen von GA-Konzentrationen umfasst.
Darüber hinaus wurden die GA-Biosensoren für die in situ GA-Produktion über verschiedene Stoffwechselwege, wie der Oxidation von Ethylenglykol, sowie der Dahms- und Weimberg-Wege für den Xylose-Katabolismus, evaluiert, was ihre Vielseitigkeit und Empfindlichkeit beweist. Außerdem wurden neue enzymatische Reaktionen zur Glykolat-Reduktion erfolgreich umgesetzt, was das Potenzial dieser Sensoren für die Untersuchung synthetischer Stoffwechselnetzwerke in vivo unterstreicht.
Parallel dazu wurden Glycerat-Biosensoren entwickelt, indem die Synthese von Serin, einer essenziellen Aminosäure, mit der Anwesenheit von Glycerat verknüpft wurde. Hierdurch wurde eine Alternative zu bestehenden Sensoren geschaffen, die den zentralen Kohlenstoffmetabolismus stören. Die hier vorgestellten Glycerat-Sensoren bieten eine verbesserte Stabilität und Genauigkeit bei der Erkennung von Glycerat. Außerdem wurde ein bereits charakterisierter Glyceratsensor weiterentwickelt, um die Stabilität für Langzeitkultivierungen zu verbessern. Während dieses Prozesses wurde eine neue Funktion des gut charakterisierten Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Enzyms entdeckt.
Die hier vorgestellte Arbeit bringt die Bereiche Biotechnologie und Metabolic Engineering voran, indem sie Biosensoren mit dem Potenzial ausstattet, als Werkzeuge für die Gemeinschaft der synthetischen Biologie zu dienen.