The crosstalk between type III secretion system and bacterial cell physiology in Yersinia
Loading...
Files
Date
Authors
Publisher
Philipps-Universität Marburg
Abstract
The type III secretion system (T3SS) is an essential virulence factor for a broad range of Gram-negative bacteria. T3SS secretion enables a direct translocation of effector proteins from the bacterial cytoplasm into the target host cell. Despite the high degree of conservation of the T3SS machinery, its regulation and role during host infection is species-specific, spanning from immune cell neutralization during host colonization to the establishment of inflammation at the suited niche. This, combined with the challenge of investigating T3SS secretion in vivo, caused a high discrepancy between the degree of characterization of T3SS machinery's mechanistic properties and T3SS regulation during infection. The knowledge that a complex interplay between secretion and bacterial cell physiology exists is rooted in the discovery of the T3SS machinery itself; secreting cells experience growth retardation. This phenotype is now regarded as secretion-associated growth inhibition (SAGI), but its molecular mechanism is far from being understood.
In the first part of this work, I further explored the impact of T3SS secretion on the cellular physiology of Yersinia enterocolitica. Yersinia is a suited model organism for studying T3SS regulation because of its homogenous induction of secretion under standard laboratory conditions. I localized and quantified the chromosomal and the T3SS-encoding Yersinia virulence plasmid (pYV) DNA to study the effects of T3SS secretion induction on the bacterial cell. I showed that upon T3SS machinery activation, the pYV is promptly upregulated in its copy number and re-localized towards the cell membrane. The plasmid rearrangements were shown to be followed by a broader chromosomal DNA re-organization. Ongoing studies are being conducted to determine if secreting cells undergo chromosomal replication or segregation failure during SAGI. It is hypothesized that bacteria deploy a mechanism called transertion to increase the efficiency of T3SS assembly or T3SS substrates (Yops) secretion. Transertion stands for coupled transcription, translation, and simultaneous protein insertion at the site of action. The presence of the target gene at the protein insertion site is a requirement during transertion. As the pYV plasmid localization showed to respond to induction of T3SS secretion, we tracked T3SS effector transcripts using mRNA fluorescent in situ hybridization coupled with super-resolution microscopy during secretion. The lack of yop mRNA enrichment at the membrane in T3SS-active cells argues against a key involvement of transertion in T3SS assembly or secretion in Yersinia.
To efficiently colonize the host, a group of Gram-negative pathogens, including Salmonella enterica and Pseudomonas aeruginosa, overcome SAGI by expressing the T3SS in a bistable way. This allows relying on a subset of cells being T3SS-active to establish infection while the rest of the population replicates and spreads. In pathogens like Shigella flexneri and Yersinia enterocolitica, division of labor has not been described so far. In the second part of this study, I investigated a previously uncharacterized level of T3SS regulation that Yersinia may employ to counteract SAGI during infection. Yersinia primarily replicates extracellularly within microcolonies, and I showed that replication is enabled by T3SS inhibition triggered by cell density and sensed throughout the colony. The downregulation is specific and reversible and is achieved via modulation of the essential activator of the T3SS, VirF, by the CsrABC system. I propose that this previously unknown, density-driven T3SS repression is crucial for Yersinia replication and dissemination following the initial stages of host colonization, during which the T3SS plays a vital role in evading the innate immune response. This study challenges the long-held assumption that there is no coordinated behavior in the regulation of T3SS.
Das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) ist ein essenzieller Virulenzfaktor für eine Vielzahl von gramnegativen Bakterien und ermöglicht die direkte Translokation von Effektorproteinen aus dem bakteriellen Zytoplasma in die Ziel-Wirtszelle. Trotz der hohen Konservierung der T3SS-Maschinerie sind deren Regulation und Rolle während der Wirtsinfektion artspezifisch. Diese reichen von der Neutralisierung von Immunzellen während der Kolonisierung des Wirts bis hin zur Auslösung von Entzündungen in der geeigneten Nische. Die Untersuchung der T3SS-Sekretion in vivo stellt eine erhebliche Herausforderung dar, was zu einer Diskrepanz zwischen der detaillierten Charakterisierung der mechanistischen Eigenschaften der T3SS-Maschinerie und deren Regulation während der Infektion geführt hat.
Das Wissen um die komplexe Wechselwirkung zwischen Sekretion und der Physiologie der bakteriellen Zelle geht auf die Entdeckung der T3SS-Maschinerie selbst zurück, da sekretierende Zellen im Wachstum beeinflusst sind. Dieses Phänomen wird heute als sekretionsassoziierte Wachstumshemmung (SAGI) bezeichnet, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bislang weitgehend unverstanden. Im ersten Teil dieser Arbeit habe ich die Natur von SAGI in Yersinia enterocolitica untersucht. Yersinia ist ein geeigneter Modellorganismus zur Untersuchung der T3SS-Regulation, da die Sekretion unter Standardlaborbedingungen homogen induziert werden kann. Um die Auswirkungen der T3SS-Sekretionsinduktion auf die bakterielle Zelle zu untersuchen, habe ich die chromosomale DNA sowie die DNA des das T3SS-kodierenden Virulenzplasmids (pYV) lokalisiert und quantifiziert. Ich konnte zeigen, dass nach Aktivierung der T3SS-Maschinerie die Kopienzahl des pYV-Plasmids schnell hochreguliert und das Plasmid in Richtung Zellmembran umgelagert wird. Diese Plasmid-Umlagerungen wurden von einer umfassenderen Reorganisation der chromosomalen DNA begleitet. Laufende Studien untersuchen, ob sekretierende Zellen während SAGI Defekte in der chromosomalen Replikation oder Segregation erleiden.
Es wird vermutet, dass Bakterien einen Mechanismus namens Transertion einsetzen, um die Effizienz der T3SS-Assemblierung oder der Sekretion von T3SS-Substraten (Yops) zu erhöhen. Transertion beschreibt die gekoppelte Transkription, Translation und gleichzeitige Integration von T3SS-Komponenten in die Membran oder von T3SS-Substraten in den Sekretionskanal, wodurch der Prozess effizienter gestaltet wird. Eine Voraussetzung für die Transertion ist die Präsenz des Zielgens an der Stelle der Proteininsertion. Da die Lokalisation des pYV-Plasmids auf die Induktion der T3SS-Sekretion reagiert, habe ich T3SS-Effektortranskripte mittels mRNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in Kombination mit superauflösender Mikroskopie während der Sekretion verfolgt. Das Fehlen einer Anreicherung von yop-mRNA an der Membran in T3SS-aktiven Zellen spricht gegen eine Beteiligung von Transertion an der T3SS-Assemblierung oder -Sekretion in Yersinia.
Um den Wirt effizient zu kolonisieren, überwinden bestimmte gramnegative Pathogene, darunter Salmonella enterica und Pseudomonas aeruginosa, SAGI, indem sie das T3SS bistabil exprimieren. Dadurch kann eine Untergruppe von T3SS-aktiven Zellen die Infektion etablieren, während der Rest der Population sich repliziert und ausbreitet. In Pathogenen wie Shigella flexneri und Yersinia enterocolitica wurde eine solche Arbeitsteilung bisher nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Studie habe ich eine bislang unbekannte Ebene der T3SS-Regulation untersucht, die Yersinia möglicherweise einsetzt, um SAGI während der Infektion zu umgehen.
Yersinia repliziert sich hauptsächlich extrazellulär innerhalb von Mikrokolonien, und ich konnte zeigen, dass diese Replikation durch eine T3SS-Hemmung ermöglicht wird, die durch die Zelldichte ausgelöst und über die gesamte Kolonie wahrgenommen wird. Diese Herunterregulation ist spezifisch, reversibel und wird durch die Modulation des essenziellen T3SS-Aktivators VirF über das CsrABC-System erreicht. Ich schlage vor, dass diese bisher unbekannte, dichtegesteuerte T3SS-Repression entscheidend für die Replikation und Verbreitung von Yersinia nach den anfänglichen Phasen der Wirtskolonisierung ist, in denen das T3SS eine entscheidende Rolle bei der Umgehung des angeborenen Immunsystems spielt. Ich bin der Ansicht, dass diese Studie die bisherige Annahme herausfordert, dass es kein koordiniertes Verhalten in der Regulation des T3SS gibt.