From RNA and its NAD-cap: Exploring T4 phage infection from an epitranscriptomic perspective
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Bacteriophages are viruses with the ability to specifically infect and kill bacteria. Bacteriophage research has shaped our understanding of fundamental biological principles and provided tools for molecular biology, but it has long been forgotten. Thus, phages are underestimated treasures of yet uncaptured biological potential and phenomena. Nowadays, while antimicrobial resistance is increasing, phage research is experiencing its renaissance, as phages present as a promising alternative to antibiotics to treat microbial infections with so-called phage therapy. Therefore, it is crucial to understand the molecular processes taking place in the intricate interplay of phages and their bacterial hosts. Bacteriophage T4 (T4 phage) represents a model phage that has been intensively studied in past decades to unravel the principles of phage infection. The T4 phage infects its prokaryotic host Escherichia coli and employs a myriad of strategies to hijack the host cell to efficiently produce phage progeny and kill the host cell. Yet, how the T4 phage accomplishes this highly efficient and fine-tuned gene expression program is not completely understood. Among others, many T4 phage genes are functionally uncharacterized, and most studies have so far focused on distinct gene expression events with targeted biochemical analyses. Consequently, comprehensive insights into the complex gene expression events and regulation during T4 phage infection are lacking.
One crucial layer of gene expression is the transcriptome, which encompasses RNA that is basically composed of four canonical nucleotides. However, RNA can be decorated by more than 160 chemical modifications referred to as the epitranscriptome. In E. coli, transcripts can possess a 5’-terminal modification with the ubiquitous redox cofactor nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), serving as a cap-like structure (NAD-cap). The E. coli RNA polymerase caps RNA molecules with NAD during transcription, and the Nudix hydrolase NudC can decap NAD-capped RNA (NAD-RNA), destabilizing these transcripts. Despite the stabilizing effect of the NAD-cap on the RNA, it is yet unclear which function the NAD-cap serves. Further, the NAD-cap and RNA modifications in general have not been studied in the context of phage infection to this day.
Addressing these knowledge gaps, this thesis sets out to comprehensively study T4 phage infection of E. coli, focusing on the transcriptome and epitranscriptome to unveil novel regulatory mechanisms of phage infection.
To realize this aim, Chapter 2 details a pioneering study that employs both time-resolved dual (phage and host) transcriptomics and dual-proteomics, offering an in-depth investigation into T4 phage infection processes. Here, these omics methods enable extensive and novel insights into phage and host gene expression on transcriptome and proteome levels during infection. Dual-transcriptomics reveals a yet unidentified set of four stable host transcripts in contrast to predominant host RNA degradation during infection and reproduces infection phase-specific T4 phage gene expression patterns on RNA level. The host proteome, on the other hand, is relatively stable, whilst T4 proteins are produced in a temporally controlled manner. Integration of the omics data reveals both temporal coupling and uncoupling of transcription and translation of specific T4 phage genes, pinpointing distinct post-transcriptional and translational regulation mechanisms. This time-resolved picture of T4 phage infection opens exciting perspectives for follow-up studies and demonstrates how state-of-the-art technologies can significantly boost our understanding of phage infections.
In Chapter 3, NAD-RNAs are identified and characterized during T4 phage infection, marking the first exploration of the dual epitranscriptome in phage biology. Both phage and host NAD-RNAs and their dynamic regulation during infection are discovered for the first time. While T4 phage NAD-RNAs dynamically appear according to their function in distinct infection phases, host NAD-RNAs mainly decrease in abundance. Moreover, their synthesis by the host RNA polymerase is demonstrated, and the first T4 phage-encoded NAD-RNA decapping enzyme, the Nudix hydrolase NudE.1, is identified and characterized. Catalytic inactivation of NudE.1 in the T4 phage decelerates infection, indicating its auxiliary role in boosting infection efficiency. Thereby, epitranscriptomics is showcased as an important research area in phage biology by comprehensively studying an RNA modification – the NAD-cap – during T4 phage infection.
Furthermore, a novel function for NAD-RNA is discovered in the context of T4 phage infection (Chapter 4). The T4 phage ADP-ribosyltransferase (ART) ModB usually accepts NAD as a substrate to ADP-ribosylate host proteins by post-translationally modifying them with ADP-ribose. Here, it is demonstrated that ModB also uses NAD-RNA as substrate, thereby covalently attaching entire RNA chains to host proteins, termed RNAylation. RNAylation by ModB is a post-translational modification of host proteins at specific arginine residues. ModB primarily RNAylates proteins of the host’s translational apparatus. Moreover, both phage and host transcripts serve as substrate RNAs for RNAylation during infection, as revealed by a specific capture and sequencing approach termed RNAylomeSeq. A T4 phage mutant of ModB displays reduced phage virulence, emphasizing the critical role of ModB for phage infection. Thus, this study presents a novel function for the NAD-cap – a post-translational protein modification creating RNA-protein conjugates, the RNAylation. It is a new way of protein-RNA interaction and presents a possible means to control critical processes during infection.
Moreover, this thesis focuses on concepts and prospects of RNA modifications in bacteria and bacteriophage-host interactions with a particular emphasis on NAD-RNAs. For one, established concepts of both internal and terminal mRNA modifications in bacteria are summarised, knowledge gaps regarding their existence, regulation and functions are highlighted, and perspectives towards their identification and characterization are provided (Chapter 5). Subsequently, the NAD-cap is highlighted as a particular RNA modification in all domains of life (Chapter 6). Therein, the identification of NAD-RNAs and the concepts of writing and erasing NAD-RNAs as well as their functions are illuminated. Challenges and future prospects – especially towards NAD-RNA functions – are discussed. Finally, the state-of-the-art in RNA modifications in the interaction of bacteriophages and their bacterial hosts is captured in Chapter 7, highlighting the rare focus of phage research on epitranscriptomics. On that basis, the putative roles of RNA modifications in phage infections are speculated.
In conclusion, this thesis provides extensive insights into bacteriophage infections from both a transcriptomic and epitranscriptomic perspective. Through this research, a fundamental and detailed temporal profile of gene expression events during T4 phage infection has been established. Based on this picture, this work defined the dynamic epitranscriptome of phage infection regarding the NAD-cap and unveiled a new function of NAD-RNAs – the RNAylation. These findings underscore the critical importance and vast potential of epitranscriptomic research in understanding phage infections, positioning this work at the forefront of an emerging interdisciplinary field.
Bakteriophagen sind Viren, die die Fähigkeit besitzen, spezifisch Bakterien zu infizieren und zu töten. Die Forschung an Bakteriophagen hat unser Verständnis von grundlegenden biologischen Prinzipien geprägt und Werkzeuge für die Molekularbiologie bereitgestellt, wurde jedoch lange Zeit vergessen. Daher sind Phagen unterschätzte Schätze von ungenutztem biologischem Potential und Phänomenen. Heutzutage, während antimikrobielle Resistenzen zunehmen, erlebt die Phagenforschung ihre Renaissance, da Phagen eine vielversprechende Alternative zu Antibiotika zur Behandlung mikrobieller Infektionen mit sogenannter Phagentherapie darstellen. Deshalb ist es entscheidend, die molekularen Prozesse, die im komplexen Zusammenspiel von Phagen und ihren bakteriellen Wirten stattfinden, zu verstehen. Der Bakteriophage T4 (T4-Phage) stellt einen Modellphagen dar, der in den vergangenen Jahrzehnten intensiv erforscht wurde, um die Prinzipien der Phageninfektion zu entschlüsseln. Der T4-Phage infiziert seinen prokaryotischen Wirt Escherichia coli und verwendet eine Vielzahl von Strategien, um die Wirtszelle zu kapern und effizient Phagennachkommen zu produzieren sowie die Wirtszelle zu töten. Doch wie der T4-Phage dieses hoch effiziente und fein abgestimmte Genexpressionsprogramm durchführt, ist nicht vollständig verstanden. Unter anderem sind viele Gene des T4-Phagen funktional nicht charakterisiert, und die meisten Studien haben sich bisher auf spezifische Genexpressionsereignisse mit gezielten biochemischen Analysen konzentriert. Folglich fehlen umfassende Einblicke in die komplexen Genexpressionsereignisse und -regulationen während der T4-Phageninfektion.
Eine entscheidende Ebene der Genexpression ist das Transkriptom, das RNA umfasst, die grundsätzlich aus vier kanonischen Nukleotiden besteht. Jedoch kann RNA durch mehr als 160 chemische Modifikationen ausgestattet werden, die als Epitranskriptom bezeichnet werden. In E. coli können Transkripte eine 5'-terminale Modifikation mit dem allgegenwärtigen Redox-Kofaktor Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) besitzen, der als kappenähnliche Struktur (NAD-Kappe) dient. Die RNA-Polymerase von E. coli „kappt“ RNA-Moleküle mit NAD während der Transkription, und die Nudix-Hydrolase NudC kann NAD-„gekappte“ RNA (NAD-RNA) „entkappen“, wodurch diese Transkripte destabilisiert werden. Trotz des stabilisierenden Effekts der NAD-Kappe auf die RNA ist unklar, welche Funktion die NAD-Kappe erfüllt. Weiterhin wurden die NAD-Kappe und RNA-Modifikationen im Allgemeinen im Kontext der Phageninfektion bis heute nicht untersucht.
Diese Wissenslücken angehend, setzt sich diese Dissertation zum Ziel, die T4-Phageninfektion von E. coli umfassend mit Fokus auf dem Transkriptom und Epitranskriptom zu studieren, um neuartige regulatorische Mechanismen der Phageninfektion aufzudecken.
Um dieses Ziel zu realisieren, beschreibt Kapitel 2 eine wegweisende Studie, die sowohl zeitlich aufgelöste duale (Phagen und Wirt) Transkriptomik als auch duale Proteomik verwendet, was eine tiefgreifende Untersuchung der T4-Phageninfektionsprozesse anbietet. Diese „Omics“-Methoden ermöglichen umfangreiche und neue Einblicke in die Genexpression von Phage und Wirt auf Transkriptom- und Proteomebene während der Infektion. Duale Transkriptomik deckt eine bisher nicht identifizierte Gruppe von vier stabilen Wirtstranskripten auf – im Gegensatz zum vorherrschenden Abbau der Wirts-RNA während der Infektion – und reproduziert infektionsphasenspezifische T4-Phagengenexpressionsmuster auf RNA-Ebene. Das Wirtsproteom hingegen ist relativ stabil, während T4-Proteine in einer zeitlich kontrollierten Weise produziert werden. Die Integration der Omics-Daten offenbart sowohl eine zeitliche Kopplung als auch Entkopplung von Transkription und Translation spezifischer T4-Phagengene, was auf unterschiedliche post-transkriptionelle und translationale Regulationsmechanismen hinweist. Dieses zeitlich aufgelöste Bild der T4-Phageninfektion eröffnet spannende Perspektiven für Folgestudien und zeigt, wie modernste Technologien unser Verständnis von Phageninfektionen signifikant verbessern können.
In Kapitel 3 werden NAD-RNAs während der T4-Phageninfektion identifiziert und charakterisiert, was die erste Erforschung des dualen Epitranskriptoms in der Phagenbiologie markiert. Sowohl Phagen- als auch Wirts-NAD-RNAs und deren dynamische Regulation während der Infektion werden erstmals entdeckt. Während T4-Phagen-NAD-RNAs dynamisch entsprechend ihrer Funktion in unterschiedlichen Infektionsphasen erscheinen, nehmen Wirts-NAD-RNAs hauptsächlich in ihrer Abundanz ab. Zudem wird ihre Synthese durch die Wirts-RNA-Polymerase demonstriert, und das erste T4-Phagen-kodierte NAD-RNA-„Entkappungs“-Enzym, die Nudix-Hydrolase NudE.1, wird identifiziert und charakterisiert. Die katalytische Inaktivierung von NudE.1 im T4-Phagen verlangsamt die Infektion und deutet auf seine unterstützende Rolle bei der Steigerung der Infektionseffizienz hin. Damit wird die Epitranskriptomik als ein wichtiges Forschungsgebiet in der Phagenbiologie vorgestellt, indem eine RNA-Modifikation – die NAD-Kappe – während der T4-Phageninfektion umfassend untersucht wird.
Des Weiteren wird eine neuartige Funktion für NAD-RNA im Kontext der T4-Phageninfektion entdeckt (Kapitel 4). Die T4-Phagen-ADP-Ribosyltransferase (ART) ModB akzeptiert üblicherweise NAD als Substrat zur ADP-ribosylierung, um Wirtsproteine durch post-translationale Modifikation mit ADP-Ribose zu modifizieren. Hier wird gezeigt, dass ModB auch NAD-RNA als Substrat verwendet und dabei ganze RNA-Ketten kovalent an Wirtsproteine anhängt, RNAylierung genannt. Die RNAylierung durch ModB ist eine post-translationale Modifikation von Wirtsproteinen an spezifischen Argininresten. ModB RNAyliert primär Proteine des translationalen Apparats des Wirts. Zudem dienen sowohl Phagen- als auch Wirtstranskripte als Substrat-RNAs für die RNAylierung während der Infektion, wie durch einen spezifischen Anreicherungs- und Sequenzierungsansatz namens RNAylomeSeq enthüllt wird. Eine T4-Phagenmutante von ModB zeigt reduzierte Phagenvirulenz und betont so die kritische Rolle von ModB für die Phageninfektion. Somit präsentiert diese Studie eine neuartige Funktion für die NAD-Kappe – eine post-translationale Proteinmodifikation, die RNA-Protein-Konjugate erzeugt, die RNAylierung. Es ist eine neue Art der Protein-RNA-Interaktion und stellt ein mögliches Mittel dar, um kritische Prozesse während der Infektion zu steuern.
Darüber hinaus konzentriert sich diese Dissertation auf Konzepte und Aussichten von RNA-Modifikationen in Bakterien und Bakteriophagen-Wirt-Interaktionen mit einem besonderen Schwerpunkt auf NAD-RNAs. Zum einen werden etablierte Konzepte sowohl interner als auch terminaler mRNA-Modifikationen in Bakterien zusammengefasst, Wissenslücken bezüglich ihrer Existenz, Regulation und Funktionen hervorgehoben und Perspektiven zu deren Identifizierung und Charakterisierung bereitgestellt (Kapitel 5). Anschließend wird die NAD-Kappe als eine besondere RNA-Modifikation in allen Lebensbereichen hervorgehoben. Darin wird die Identifizierung von NAD-RNAs und die Konzepte des „Schreibens“ und „Löschens“ von NAD-RNAs sowie deren Funktionen beleuchtet (Kapitel 6). Herausforderungen und zukünftige Aussichten – insbesondere hinsichtlich der Funktionen von NAD-RNAs – werden diskutiert. Schließlich wird der Wissensstand zu RNA-Modifikationen in der Interaktion von Bakteriophagen und ihren bakteriellen Wirten in Kapitel 7 erfasst, wobei der seltene Fokus der Phagenforschung auf Epitranskriptomik hervorgehoben wird. Auf dieser Basis wird über mutmaßliche Rollen von RNA-Modifikationen in Phageninfektionen spekuliert.
Zusammenfassend bietet diese Dissertation umfangreiche Einblicke in Bakteriophageninfektionen sowohl aus einem transkriptomischen als auch einem epitranskriptomischen Blickwinkel. Durch diese Forschung wurde ein fundamentales und detailliertes zeitliches Profil von Genexpressionsereignissen während der T4-Phageninfektion etabliert. Basierend auf diesem Bild definierte diese Arbeit das dynamische Epitranskriptom der Phageninfektion bezüglich der NAD-Kappe und enthüllte eine neue Funktion von NAD-RNAs – die RNAylierung. Diese Erkenntnisse unterstreichen die kritische Bedeutung und das immense Potential der epitranskriptomischen Forschung im Verständnis von Phageninfektionen und positionieren diese Arbeit an der Spitze eines aufkommenden interdisziplinären Feldes.