Untersuchung einer transienten Bindetasche am Beispiel der humanen Aldose Reduktase durch hochaufgelöste Röntgenkristallstrukturen mithilfe von Mutations- und Ligandstudien
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Immer mehr Menschen leiden an Diabetes mellitus, einer Stoffwechselerkrankung, wobei der erworbene Diabetes Typ II in unserer Gesellschaft auf beunruhigende Weise immer weiter ansteigt. Eine unbehandelte Hyperglykämie führt in aller Regel zu ernsten Folgeerkrankungen wie Herzkreislauferkrankungen, Schlaganfall, Nephropathien, Neuropathien oder Retinopathien. Eine Idee zur Behandlung der diabetischen Folgeschäden sind Eingriffe in den Polyolstoffwechselweg, wobei die Adressierung der humanen Aldose Reduktase (hAR) ein vielversprechender Ansatzpunkt ist.
Obwohl die humane Aldose Reduktase das wahrscheinlich am besten untersuchteste Protein ist, mit Kristallstrukturen von durchschnittlichen Auflösungen von <1.0 Å, gibt es noch keinen geeigneten Therapieansatz zur Inhibition der hAR. In der vorliegenden Arbeit wurde die humane Aldose Reduktase als Modellprotein für die Aufklärung von transienten Taschen und zur Aufklärung von Wirkmechanismen verwendet. Ein Austausch einer einzelnen Aminosäure in der aktiven Tasche, die für das Öffnen und Schließen dieser Spezifitätstasche verantwortlich ist, führte zur permanenten Öffnung, Flutung von Wassermolekülen und Bindung von Liganden, die im Wildtyp nicht in der Lage waren, die Tasche überhaupt zu öffnen. Durch Mutagenese geeigneter Aminosäuren wurden fünf verschiedene Varianten hergestellt und durch heterologe Expression in E. coli produziert. Die aufgereinigten Proteine wurden mithilfe der Röntgenkristallografie und zwei isostrukturellen Liganden analysiert. Dabei wurde vor allem die transiente Tasche untersucht, wobei auf die Aminosäuren, die das Öffnen und Schließen regulieren, ein besonderer Fokus gelegt wurde. Alle getesteten Varianten konnten mit einer Auflösung von ~1 Å bestimmt werden. Aufgrund der räumlichen Verkürzung der Torwächter Aminosäure Leu300, findet bei einer Besetzung des Liganden in die transiente Tasche kein Peptidflip mehr satt. Die Vorflutung durch Wassermoleküle dieser Tasche hat vermutlich nicht, wie erst gedacht, einen günstigen entropischen Einfluss auf die Ligandbindung.
In einem weiteren Projekt wurde eine Ligandserie an der humanen Aldose Reduktase kristallografisch und über TSA-Messungen untersucht. Ursprünglich sollten potentielle Liganden an der Schistisosomalen AR untersucht werden. Schistosomiasis, oder auch Bilharziose genannt, gehört heutzutage laut WHO (World Health Organization) zu den vernachlässigten Tropenkrankheiten, die durch Schistosoma verursacht wird. Geeignete Inhibitoren gegen die Schistosomale AR könnten ein Ansatzpunkt für eine alternative Behandlungsstrategie gegen die Infektion darstellen. Praziquantel wird hauptsächlich als Therapie gegen Schistosomiasis eingesetzt aber durch die Massenanwendung ist die Sorge groß, dass sich Resistenzen entwickelt haben, weshalb ein weiterer Therapieansatz nötig ist. Da im Rahmen dieser Arbeit keine geeigneten Kristallisationsbedingungen für die SmAR (Schistosoma mansoni Aldose Reduktase) gefunden werden konnten, wurden die von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. SCHLITZER bereitgestellten Liganden an der humanen AR getestet, die strukturell der SmAR sehr ähnlich ist. Zwei Liganden konnten durch Röntgenkristallografie als Binder an der hAR identifiziert werden, die ebenso in den TSA-Messungen einen stabilisierenden Effekt auf das Protein hatten. Durch verschiedene Soaking-Bedingungen konnten die hAR-Strukturen in Komplex mit Schl32357 und Schl44172 bestimmt werden.
Das dritte Projekt der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit kovalenten Fragmenten, die das Interesse in der Medikamentenentwicklung erst in den letzten Jahren geweckt hat. „Zielgerichtete kovalente Inhibitoren“ (targeted covalent inhibitors, TCI) tragen eine funktionelle Gruppe, mit der sie eine kovalente Bindung mit dem Zielprotein eingehen und eine Inhibition dieser bewirken. Im ersten Schritt der Bindung, wechselwirkt der kovalente Ligand in einer Gleichgewichtsreaktion mit dem Zielprotein. Erst im 2. Schritt findet die eigentliche kovalente Bindung statt, die als reversibel bis hin zu irreversibel klassifiziert werden kann. Obwohl die hohe Wirksamkeit und die zielgerichtete „Stummschaltung“ von Enzymen ein Vorteil von kovalenten Inhibitoren sind, muss die verlängerte Wirkungsdauer wegen Toxizitätsproblemen ebenso betrachtet werden. Um die Wirkungsweise von kovalenten Fragmenten einerseits und die Einführung neuartiger Inhibitoren andererseits zu untersuchen, wurde hier ebenfalls als Zielenzym die humane Aldose Reduktase gewählt. Es wurden hochreaktive Reagenzien von der Firma SPIROCHEM bezogen, die als reaktive Gruppen entweder Halogenacetate, Azetidine und Oxirane oder MICHAEL-Akzeptoren waren. Cys298 der hAR befindet sich in der aktiven Tasche und sollte adressiert werden. Es wurde bereits gezeigt, dass die Modifikation des Cys298 mit unterschiedlichen Reagenzien die Enzymaktivität aktivieren oder hemmen kann. Über Massenspektrometrie wurden die verschiedenen kovalenten Fragmente analysiert und zwei positive Hits gefunden. Die hAR-Kristalle wurden durch die SmartSoak® Methode von CRYSTALSFIRST in eine Ligandlösung für eine bestimmt Zeit eingelegt und anschließend röntgenkristallografisch untersucht. Dabei konnten die Strukturen in Komplex mit den beiden Fragmenten, die kovalent an Cys298 gebunden haben, bestimmt werden. Jedoch führte die kovalente Bindung der beiden Liganden in beiden Strukturen dazu, dass die flexible C-terminale Schleife aufgrund einer zu schlecht definierten Elektronendichte nicht eingebaut werden konnte.
More and more people are affected by diabetes mellitus, a metabolic disease, with acquired type II diabetes. The disease is on the rise in our society at an alarming rate. Untreated hyperglycemia generally leads to serious secondary side effects such as cardiovascular diseases, stroke, nephropathy, neuropathy or retinopathy. One idea for the treatment of diabetic complications is to intervene in the polyol metabolic pathway, whereby addressing human aldose reductase (hAR) is a promising starting point.
Although human aldose reductase is probably the best studied protein, with crystal structures of average resolution <1.0 Å, there is still no suitable therapeutic approach to inhibit hAR. In the present study, human aldose reductase was used as a model protein for the elucidation of the opening of a transient pocket and the mechanism of action. Replacement of a single amino acid in the active pocket, which is responsible for opening and closing this specificity pocket, led to permanent opening, flooding of water molecules and binding of ligands that were not able to open the pocket at all in the wild type. Five different variants were produced by mutagenesis of suitable amino acids and produced by heterologous expression in E. coli. The purified proteins were analyzed using X-ray crystallography and two isostructural ligands. In particular, the transient pocket was examined, with special focus on the amino acids that regulate opening and closing. All tested variants could be determined with a resolution of ~1 Å. Due to the spatial truncation of the gatekeeper amino acid Leu300, no peptide flip takes place when the ligand occupies the transient pocket. The preflooding by water molecules of this pocket probably does not have a favorable entropic influence on ligand binding, as initially thought
In a further project, a series of ligands on human aldose reductase was investigated crystallographically and using TSA measurements. The original aim was to investigate potential ligands on schistosomal AR. According to the WHO (World Health Organization), schistosomiasis, also known as bilharzia, is one of the neglected tropical diseases caused by Schistosoma. Suitable inhibitors against schistosomal AR could represent a starting point for an alternative treatment strategy against the infection. Praziquantel is mainly used as drug therapy against schistosomiasis, but due to its massive use there is great concern with respect to resistance develoment, which is why another therapeutic approach is needed. Since no suitable crystalization conditions for SmAR (Schistosoma mansoni aldose reductase) could be found in the context of this work, the ligands provided by Prof. Dr. SCHLITZERS working group were tested on human AR, which is structurally very similar to SmAR. Two ligands were identified as binders on the hAR by X-ray crystallography, which also had a stabilizing effect on the protein in the TSA measurements. Different soaking conditions were used to determine the hAR structures in complex with Schl32357 and Schl44172.
The third project in this thesis dealt with covalent fragments, which have only recently attracted interest in drug development. "Targeted covalent inhibitors" (TCI) carry a functional group with which they form a covalent bond with the target protein and inhibit it. In the first step of binding, the covalent ligand interacts with the target protein in an equilibrium reaction. Only in the second step does the actual covalent binding take place, which can lead to reversible up to irreversible inhibition. Although the high efficacy and the targeted "silencing" of enzymes are an advantage of covalent inhibitors, the prolonged duration of action must also be considered due to toxicity problems. In order to investigate the mode of action of covalent fragments on the one hand and the introduction of novel inhibitors on the other, human aldose reductase was also chosen as the target enzyme here. Highly reactive reagents were obtained from the company SPIROCHEM, which were either haloacetates, acetidines and oxiranes or MICHAEL-acceptors as reactive groups. Cys298 of hAR is located in the active pocket and should be addressed. It has already been shown that the modification of Cys298 with different reagents can activate or inhibit enzyme activity. The different covalent fragments were analyzed by mass spectrometry and two successful hits were found. The hAR crystals were placed in a ligand solution for a specific time using the SmartSoak® method from CRYSTALSFIRST and then examined by X-ray crystallography. The structures in complex with the two fragments covalently bound to Cys298 could be determined. However, the covalent binding of the two ligands in both structures meant that the flexible C-terminal loop could not be built in due to insufficiently defined electron density.
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