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Philipps-Universität Marburg
Abstract
The type III secretion system (T3SS) is an essential virulence factor of many pathogenic bacteria
including Yersinia enterocolitica. This nanomachine injects effector proteins and delivers them
into the cytoplasm of the target eukaryotic cells, where they modulate the immune responses of
the host in order to promote bacterial colonization and infection. Although the central feature of
T3SS is effector export, the critical steps of the secretion process such as the selection and
recruitment of effector proteins are still poorly understood. Previous studies suggest that the
sorting platform plays a role in recruiting effectors to the machinery and helps in establishing
export hierarchy. These conserved proteins organize into dynamic shuttle pod (sorting platform)
structures at the cytosolic interface of the injectisome. To address the link between effector export
and the dynamic nature of the cytosolic sorting platform, we performed a series of in vivo
biochemistry techniques. Based on our single particle tracking and proximity labelling data, we
found that the dynamic cytosolic T3SS components SctQ and SctL specifically bind to effectors
in live bacteria during secretion. This complex then shuttles and targets the effectors to the
membrane-bound injectisome, likely directing them to the export gate for subsequent secretion.
Moreover, some T3SS effectors are often co-expressed with their cognate chaperone proteins
and are required for effector export; however, no common mechanism of action has been found.
Hence, we explored whether chaperone proteins contribute to the targeting of effectors into the
injectisome. Since mapping the interactions of chaperone proteins will shed light on their function
in effector export, we performed protein-protein interaction studies. Our data revealed strong
interaction of chaperones to their respective effector proteins and additional T3SS components
including the small negative regulators YscM1/2. Most importantly, our results notably failed to
detect enrichment of the cytosolic sorting platform components (SctQ/K/L/N), implying that there
is no direct interaction with chaperone proteins in live Yersinia. Further evidence came from the
observation that SycH's mobility remained unchanged in the absence of the sorting platform
complex based on our single particle tracking data. Thus, chaperones do not form a complex with
the sorting platform components. Taken together, our findings revealed that chaperone dimer
binds to a single effector in the cytosol, keeping them in a secretion-competent state, and transfers
them to specific components of the shuttle pods (SctQ and SctL), which in turn delivers the cargo
to the membrane-bound T3SS injectisome.
Das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) ist ein wesentlicher Virulenzfaktor vieler pathogener
Bakterien, einschließlich Yersinia enterocolitica. Diese Nanomaschine injiziert Effektorproteine
und bringt sie in das Zytoplasma der eukaryontischen Zielzellen, wo sie die Immunreaktionen des
Wirts modulieren, um die bakterielle Besiedlung und Infektion zu fördern. Obwohl das zentrale
Merkmal von T3SS der Export von Effektorproteinen ist, sind die kritischen Schritte des
Sekretionsprozesses wie die Auswahl und Rekrutierung von Effektorproteinen noch wenig
verstanden. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die Sortierplattform eine Rolle bei der
Rekrutierung von Effektoren für die Maschinerie spielt und bei der Festlegung der
Exporthierarchie hilft. Diese konservierten Proteine organisieren sich in dynamischen Shuttle-
Pod-Strukturen (Sortierplattform) an der zytosolischen Schnittstelle des Injektisoms. Um den
Zusammenhang zwischen dem Export von Effektoren und der dynamischen Natur der
zytosolischen Sortierplattform zu untersuchen, haben wir eine Reihe von in vivo biochemischen
Verfahren durchgeführt. Auf der Grundlage unserer Daten zur Einzelpartikelverfolgung und
Proximity-Markierung haben wir festgestellt, dass die dynamischen zytosolischen T3SSKomponenten
SctQ und SctL während der Sekretion spezifisch an Effektoren in lebenden
Bakterien binden. Dieser Komplex transportiert die Effektoren dann zum membrangebundenen
Injektisom und lenkt sie wahrscheinlich zum Exporttor für die anschließende Sekretion. Darüber
hinaus werden einige T3SS-Effektoren häufig zusammen mit den zugehörigen
Chaperonproteinen exprimiert und sind für den Export der Effektoren erforderlich; es wurde
jedoch kein gemeinsamer Wirkmechanismus gefunden. Daher untersuchten wir, ob
Chaperonproteine zur Ausrichtung von Effektoren auf das Injektisom beitragen. Da die Kartierung
der Interaktionen von Chaperonproteinen Aufschluss über ihre Funktion beim Effektor-Export
geben wird, führten wir Protein-Protein-Interaktionsstudien durch. Unsere Daten zeigten eine
starke Interaktion von Chaperonen mit ihren jeweiligen Effektorproteinen und zusätzlichen T3SSKomponenten,
einschließlich der kleinen negativen Regulatoren YscM1/2. Vor allem aber
konnten wir keine Anreicherung der Komponenten der zytosolischen Sortierplattform
(SctQ/K/L/N) feststellen, was bedeutet, dass es in lebenden Yersinien keine direkte Interaktion
mit Chaperonproteinen gibt. Ein weiterer Beleg dafür war die Beobachtung, dass die Mobilität von
SycH in Abwesenheit des Sortierplattformkomplexes unverändert blieb, wie unsere Daten aus
der Einzelpartikelverfolgung zeigen. Die Chaperone bilden also keinen Komplex mit den
Komponenten der Sortierplattform. Insgesamt haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass das
Chaperondimer an einen einzelnen Effektor im Zytosol bindet, ihn in einem sekretionsfähigen
Zustand hält und ihn auf spezifische Komponenten der Shuttle-Pods (SctQ und SctL) überträgt,
die wiederum die Ladung an das membrangebundene T3SS-Injektisom liefern.