Mutationsstudien und Strukturanalysen der proteinbasierten RNase P aus dem hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus und Homologen
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Philipps-Universität Marburg
Abstract
Der Reifungsprozess von Transfer-RNAs (tRNAs) ist essenziell für die Proteinbiosynthese und
kommt in allen Lebensformen vor. Ein wichtiger Schritt dieser Maturierung ist die
endonukleolytische Abspaltung der 5’-Flanke einer Vorläufer-tRNA (Prä-tRNA) durch das
Enzym Ribonuklease P (RNase P). Eine Form der RNase P, die in allen drei Domänen des
Lebens vorkommt, besteht aus einer katalytischen RNA und einem Proteinanteil. Hierbei
variiert der Proteinanteil von einer Untereinheit in Bakterien, über vier bis fünf in Archaeen
und bis zu zehn in Eukaryoten. Es existieren jedoch auch ausschließlich proteinbasierte
Formen der RNase P in Eukaryoten. Dazu gehören die RNase P tierischer Mitochondrien
(mtRNase P), die einen Komplex aus drei Protein-Untereinheiten bildet. Zur Nuklease-
Untereinheit der mtRNase P homologe Enzyme, die als Einzelprotein aktiv sind und als
protein-only RNase P (PRORP) bezeichnet werden, wurden auch in vielen anderen
Eukaryonten gefunden, wie z.B. in der Landpflanze Arabidopsis!thaliana. Kürzlich wurde
zudem eine proteinbasierte RNase P-Form in dem hyperthermophilen Bakterium Aquifex!
aeolicus identifiziert, welche eine PilT N-terminus (PIN)-ähnliche Nukleasedomäne besitzt
und ausschließlich aus einer nur etwa 23 kDa großen Proteinkomponente besteht, die
allerdings oligomerisieren kann. Homologe der Aquifex RNase P (HARPs) werden ebenfalls in
einigen anderen Bakterien und zahlreichen Archaeen exprimiert, wobei sie in diesen
Archaeen immer gemeinsam mit der RNA-basierten RNase P vorliegen und nicht die Haupt-
RNase P-Aktivität darstellen. Die Funktion der HARPs in Archaeen ist bisher unbekannt und
wenig untersucht.
Um herauszufinden, wie die zuvor erwähnten kleinen HARP-Proteine das Prä-tRNA-Substrat
erkennen und binden, wurden Mutationsstudien der A.!aeolicus RNase P (AaRP)
durchgeführt. Zudem wurde ein Fokus auf die Strukturanalyse der AaRP und anderer HARPs
gelegt, um mithilfe verschiedener Methoden Informationen über den Aufbau des Enzyms
und dessen Funktion zu gewinnen. Aufgrund der konformativen Heterogenität des Cterminalen
Endes des His-tag-markierten AaRP-Proteins (ORF Aq880) konnte von unserer
Seite jedoch keine Struktur der AaRP auf atomarer Ebene generiert werden.
Massenphotometrie-Daten zeigten allerdings, dass das homologe Protein aus
Halorhodospira! halophila (ORF Hhal2243) im Gegensatz zu Aq880 in einem homogenen
Strukturzustand vorlag, sodass mittels Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) die Apo-
Struktur des bakteriellen HARPs aus H.!halophila mit 3,37 Å gelöst werden konnte. Es stellte
sich heraus, dass das monomere Protein (!24 kDa) schraubenartig zu einem Dodecamer
oligomerisiert. Höhere Oligomere sind aus sterischen Gründen ausgeschlossen. Zwei
Hhal2243-Monomere bilden ein stabiles Dimer, indem sich ihre "Spike-Helix"(SH)-Domänen,
bestehend aus den beiden Helices"#5"und #6,"zu"einem"4-Helix-Bündel zusammenlagern. So
ragen insgesamt sechs dieser Helix-Bündel aus der dodecameren Anordnung heraus. Die
hervorstehenden Spike-Helices von HARP-Dimeren, die die konservierte Ellbogen-Region der
tRNA binden, tragen maßgeblich zur Substratbindung bei. Ein Docking-Modell sagt vorher,
dass"die" zu"prozessierende" 5'-Flanke wiederum in das aktive Zentrum eines benachbarten Dimers ragen würde und somit ein Tetramer die kleinste funktionelle Einheit für die
enzymatische Spaltung von Prä-tRNA-Substraten darstellt. Die gelöste Kryo-EM Struktur
stellt eine wichtige Grundlage für weitere Forschungen zum biologischen und
mechanistischen Verständnis der tRNA-Prozessierung durch prokaryotische HARPs dar.
The maturation process of transfer RNAs (tRNAs) is essential for protein biosynthesis and
occurs in all domains of life. An important step in the maturation is the endonucleolytic
removal of the 5’-leader sequence from the precursor tRNA (pre-tRNA) by the ribonuclease P
(RNase P). RNase P occurs as a ribonucleoprotein enzyme in all three domains of life and is
composed of a catalytic RNA and a protein moiety. The protein content varies from one
subunit in bacteria, four to five in archaea and up to ten in eukaryotes. However, there are
also exclusively protein-based forms of RNase P in eukaryotes, such as the mitochondrial
RNase P complex (mtRNase P) of animal mitochondria consisting of three different protein
subunits. Homologs of the nuclease subunit of mtRNase P were also identified in many other
eukarya where they act as a single protein enzyme termed PRORP, a prominent model
system being the PRORP of the land plant Arabidopsis thaliana. Recently, a protein-based
RNase P form was identified in the hyperthermophilic bacterium Aquifex! aeolicus, which
possesses a PIN-like nuclease domain and is soley composed of protein as small as about
23 kDa. Aquifex RNase P homologues (HARPs) are also expressed in some bacteria and
numerous archaea. In all of these archaea, the HARPs coexist with the RNA-based RNase P
and do not represent the main RNase P activity. The main function of HARPs in Archaea is
unknown.
To elucidate how HARPs are able to recognize and bind the pre-tRNA substrate, mutational
studies of the Aquifex! aeolicus! RNase P (AaRP) were performed. In addition, a focus was
placed on the structural analysis of AaRP and other HARPs using different methods.
However, due to the heterogeneity of the C-terminally labeled AaRP (ORF Aq880), we were
unable to solve the structure of AaRP by X-ray crystallography or cryo-electron microscopy
(cryo-EM). However, mass photometric data revealed that the homologous recombinant
protein of the bacterium Halorhodospira! halophila (ORF Hhal2243) assemble into a
homogeneous structure, in contrast to Aq880. Hence, the apo structure of the bacterial
HARP from H.! halophila! could be solved with 3.37 Å by cryo-EM. It turned out that the
monomeric protein (~24 kDa) forms a homo dodecamer via a screw-like assembly. Due to
steric reasons, higher oligomers are excluded. Two Hhal2243 monomers form a stable dimer
via association of their spike-helix (SH) domains"consisting of helices alpha5 and alpha6, resulting
in a 4-helix bundle. Thus, a total of six such helix bundles protrude from the dodecameric
structure. The protruding spike helices of HARP dimers make a major contribution to
substrate binding through interaction with the conserved elbow region of tRNAs. A proposed
docking model predicts that the 5’-leader to be processed would then reach into the active
centre of the neighbouring dimer, suggesting that a tetramer represents the smallest
functional unit for cleavage of pre-tRNA substrates. The solved cryo-EM structure provides
an important basis for future studies aiming at the biological and mechanistic understanding
of pre-tRNA processing by prokaryotic HARPs.